研究背景Wnt/β-catenin信号通路在调控胚胎发育和组织再生等过程中具有十分重要的作用,其异常激活与多种癌症,尤其是结直肠癌的发生密切相关。结肠腺瘤样息肉(Adenomatous Polyposis Coli, APC)基因是Wnt/β-catenin信号通路的关键负向调节因子,其失活是结直肠癌发生的早期分子事件。临床研究发现,70-80%的散发性结直肠癌存在APC缺失或突变,产生截短型APC蛋白,激活Wnt/β-catenin信号通路,在细胞迁移、染色体分离和转录调节等方面具有多样性作用。一方面,APC参与β-catenin的识别、磷酸化和靶向降解过程；另一方面,APC可能作为核穿梭蛋白,在β-catenin的核转运过程中发挥某些特定作用,从而降低其核水平及转录活性。β-catenin的磷酸化是Wnt通路的关键环节,降解复合体(destruction complex)是调节这一过程的重要因素,但其具体机制仍然存在着广泛的争议,经典模型认为,APC和Axin都作为支架蛋白,确保β-catenin磷酸化的特异性,并调控Wnt信号通路。Munemitsu等认为APC突变或缺失可导致β-catenin聚集,提出APC对β-catenin的磷酸化是必不可少的。此外,APC能够进一步增强Axin-GSK3复合体对磷酸化β-catenin的亲和力。但也有研究提出,当细胞中Axin水平足够高时,APC的作用价值不大,Axin是Wnt通路的限制因素。尽管学者们对APC在Wnt通路中的作用等方面进行了大量研究,但APC的生物学功能至今仍然存在着很多未知的方面,且目前研究大多是在β-catenin稳定表达状态下进行的,有必要建立激酶实验方法直接检测内源性β-catenin的磷酸化活性,进一步明确APC或截短型APC在Wnt通路中对β-catenin磷酸化的调节作用,其对了解结肠癌等肿瘤的发病机制具有重要意义。基于上述问题,本课题通过激酶检测实验比较SW480(APC第1338个密码子发生突变)和SW480APC(稳定转染全长APC的SW480APC细胞株,由Antony Burgess馈赠)两种细胞株中β-catenin的激酶活性,应用siRNA干扰和Axin过表达等方法初步探讨了APC在β-catenin磷酸化过程中的作用,利用点突变技术构建APC△15(R386A)、APC△20(K345A, W383A)突变型β-catenin重组蛋白,分析APC发挥作用的具体结构区域。并采用细胞分级等方法从亚细胞水平阐述APC对Wnt通路β-catenin磷酸化调节的作用,明确其发生部位。此外,本研究还应用荧光漂白后恢复(FRAP)技术研究β-catenin核转运的动力学特征以及APC在其中可能发挥的作用,为进一步研究Wnt通路提供一定的依据。第一部分APC和肿瘤相关截短型APC对Wnt通路β-catenin磷酸化的调节作用目的：分析SW480细胞和SW480APC细胞中Wnt通路主要相关蛋白的表达情况及β-catenin磷酸化活性,探讨截短型APC和野生型APC基因产物在β-catenin磷酸化过程中的调节作用。方法：1.Western blot方法检测SW480细胞和SW480APC细胞总提取物中APC、Axin、GSK3和CK1的表达情况。2.分别以野生型β-catenin和突变型S45D β-catenin为底物进行激酶实验,检测磷酸化β-catenin蛋白(pSer45和pSer33/Ser37/Thr41)在SW480细胞和SW480APC细胞中的激酶活性水平。3.应用WC siRNA干扰和瞬时转染Axin技术,激酶实验检测β-catenin在APC缺失或Axin过表达情况下的磷酸化活性。4.利用点突变技术,构建APC△15(R386A)、APC△20(K345A)和APC△20(W383A)三种突变型β-catenin重组蛋白作为底物进行激酶实验,并与野生型β-catenin底物比较,检测磷酸化β-catenin的变化情况。结果：1.SW480和SW480APC细胞中Wnt通路组成特性：除SW480APC细胞中可见明显的低表达量的全长APC外,其它蛋白如Axin、GSK3和CK1等的表达量基本相同。2.本研究建立了直接检测结肠癌细胞株SW480细胞中内源性P-catenin磷酸化活性的激酶实验方法。发现以野生型P-catenin为底物时,SW480APC细胞中两种磷酸化P-catenin (pSer45和pSer33/Ser37/Thr41)的水平显著高于SW480细胞,其中pSer45β-catenin水平升高5倍,pSer33/Ser37/Thr41β-catenin水平升高2倍；以S45D β-catenin为底物进行激酶实验的结果表明,SW480APC细胞中pSer33/Ser37/Thr41β-catenin活性也明显高于SW480细胞的磷酸化活性。3.利用siRNA敲除APC后,两种细胞株中p-catenin的激酶活性均显著降低,其降低程度与全长APC缺失程度,特别是截短APC缺失程度相关。中度Axin异位表达(SW480细胞中2.3倍,SW480APC细胞中2.5倍)未能显著刺激β-catenin磷酸化水平增高,且SW480细胞中可见Ser45β-catenin活性轻度降低。4.与野生型β-catenin底物相比,以三种突变型β-catenin重组蛋白为底物进行激酶实验,其β-catenin磷酸化活性均降低,并显著见于APC△20(K345A)和APC△20(W383A) β-catenin突变体,在APC△15(R386A) β-catenin突变体中的磷酸化活性减弱程度相对较轻。结论：1.本研究建立了直接检测结肠癌细胞株SW480细胞中内源性β-catenin磷酸化活性的激酶实验方法。发现APC可直接调节Wnt通路β-catenin的磷酸化过程,并且参与CK1及GSK3介导的两个磷酸化阶段。2.SW480细胞中截短APC片段仍能在β-catenin磷酸化过程中发挥较大的作用。Axin并不是β-catenin磷酸化的限制因素,过量表达Axin并不能补偿APC的调节作用。3.证明了APC结构中的15和20氨基酸重复序列,特别是第一个20氨基酸重复序列结构在β-catenin磷酸化过程中发挥重要的作用。目的：分析SW480细胞和SW480APC细胞中Wnt通路降解复合体主要组成蛋白及β-catenin磷酸化活性的亚细胞定位,进一步探讨β-catenin磷酸化的发生部位。方法：1.利用细胞分级方法,检测SW480和SW480APC细胞中Wnt通路降解复合体主要组成蛋白APC、Axin、GSK3和CKl等在细胞浆(Cs)、细胞核可溶成分(Ns)和细胞核不可溶成分(Ni)、膜类成分(M)及由细胞核和细胞骨架等成分组成的致密不可溶性混合物成分(X)中的表达情况。2.分别以野生型和S45D突变型β-catenin为底物,对各亚细胞组分进行激酶实验,Western Blot检测pS45和pS33/S37/T41β-catenin水平。3.应用蔗糖密度区带离心方法进一步分离X组分,激酶实验检测不同密度区带离心后各组分中β-catenin的磷酸化水平。Western Blot检测各组分中APC、Axin、 GSK3、CK1α、CK1ε及相关亚细胞结构标志物pericentrin、γ-tubulin、Lamin、LRP等的分布情况。4.SW480和SW480APC细胞经25mM LiCl培养20min后,加入洋地黄皂苷4℃C缓慢摇10min后固定,免疫荧光分别观察LiCl处理组细胞和对照组细胞内APC、CK1αt和pS33/S37/T41β-catenin的共定位情况。结果：1.两种细胞株亚细胞结构中的分布模式基本一致。全长APC及其截短片段可见于Cs、Ni和X组分中,但主要仍集中于Cs中。Axin、CK1α和GSK3主要分布于Cs和X中,而CKlε主要分布于X组分中。2. β-catenin磷酸化活性主要发生在X组分中(约占总活性的60-70%),Cs中的活性相对较弱(仅为10～20%),Ni中磷酸化β-catenin程度接近Cs水平；Ns或M组分中活性很低或未见β-catenin的磷酸化。3.X组分经蔗糖密度区带离心后,在沉降池内从液面到底部可分为13个不同的密度区带(F1-F13)。激酶活性主要见于下层高密度组分中(F8-F10),Western Blot证实其与中心体富集区域相关。4. SW480APC细胞中,APC、Axin、CK1α和CK1ε主要分布于第F8-F10组分中,这与中心体定位和激酶活性发生部位一致。GSK3主要集中于低密度组分中,少量可见于底部高密度区域。而在SW480细胞中,可见CKla高表达于F9组分,其他各蛋白则呈弥散分布。5.共聚焦显微镜免疫荧光结果显示：APC与CKla共定位于细胞核周边的胞浆中,γ-tubuli染色结果表明该区域与中心体定位一致,并发现pS33/S37/T41β-catenin也在此处表达。应用GSK3抑制剂LiCl处理细胞后免疫荧光结果进一步确认了pS33/S37/T41β-catenin的中心体定位。结论：1.Wnt通路降解复合体主要组成蛋白(APC、Axin、GSK和CK)主要集中于Cs和X组分中,其分布与β-catenin磷酸化活性发生部位一致。2.完善建立了可用于分离SW480细胞中心体的方法,证实了中心体是β-catenin磷酸化活性发生的关键部位,β-catenin的磷酸化与以中心体相关的共沉淀复合物形成相关。目的：研究β-catenin核转运的动力学特征,探讨APC对β-catenin入核和出核运动的影响。方法：1.瞬时转染YFP-β-catenin、GFP、Cherry-NLS质粒24-36h后,比较β-catenin在核内和胞浆内的相对稳态分布情况。应用FRAP技术观察并检测这些荧光蛋白在SW480和SW480APC细胞内的分布和核内运动情况。应用二元扩散经验方程对所得数据进行拟合曲线分析。2.比较SW480细胞和SW480APC细胞中β-catenin的核转运过程。应用APCsiRNA转染SW480细胞24-36h后,比较APC敲除组细胞与对照组细胞内YFP-β-catenin核转运的动力学变化。3.SW480和SW480APC细胞转染YFP-β-catenin24h后,应用出核转运抑制剂LMB分别预处理细胞4h和8h, FRAP观察β-catenin的核转运变化情况。结果：1. GFP、Cherry-NLS及不同条件下的YFP-β-catenin的核/浆比例相近,(中位数～1.2)。含不同β-catenin表达水平的各个细胞间差异不影响其荧光恢复的动力学特征。2.SW480细胞的动力学特征符合二元扩散经验方程,即早期快速运动时相(K～0.1/sec,tl/2<10s)和后期相对缓慢的恢复时相(迁移速率K～0.01/sec,t1a>lmin)。其中,早期快速时相的扩散运动与野生型全长APC或截短APC无显著相关性。SW480细胞中β-catenin入核和出核的早期运动时相速度几乎与GFP表现一致,但5min后达到平台期时仅能恢复60-80%。β-catenin的核转运速度快于Cherry-NLS的表现。3.与SW480细胞相比,β-catenin在SW480APC细胞中的慢性恢复时相期的动力学降低,其半衰期时间从1min到5min不等,这与全长APC导致β-catenin广泛停留相关。对于β-catenin的核输出,全长APC的表达对其并无任何影响,但截短APC能够加速早期快速移动时相过程。比较SW480和APC敲除后SW480细胞的核转运功能,发现APC敲除后,各阶段的相对比例显著改变,表现为快速时相期的增快和后期荧光恢复程度增强。4.LMB作用4h后,β-catenin的入核与出核运动未见明显改变。LMB处理8h后,可见β-catenin入核运动显著加快,早期移动时相高于APC敲除细胞,几乎与GFP的动力学变化一致；LMB对β-catenin的出核过程无影响。结论：1.本研究证实了APC作为核穿梭蛋白,在β-catenin的核转运过程中具有重要作用,可能影响肿瘤细胞中β-catenin的核内功能,这对进一步研究Wnt/β-catenin通路提供一定的依据。2.野生型全长APC可引起β-catenin滞留,导致β-catenin入核运动减慢,但对其出核运动无明显改变。截短APC能够加速β-catenin早期快速入核过程,这一变化在APC缺失时更为明显,表明截短APC对β-catenin入核和出核运动的重要影响。