核盘菌基因SsAna功能研究

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核盘菌会寄生多种植物,引起油菜菌核病等多种病害。核盘菌侵染植物时,一般情况下会导致植物坏死,对作物造成巨大伤害。在我国,油菜菌核病在油菜种植地区均有发生,油菜与油料产品的生产息息相关。因此研究核盘菌的致病机制,寻找解决核盘菌造成病害的方法非常有意义。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(Anabf A)在真菌中广泛存在,主要与其他水解酶一同参与半纤维素的水解,与细胞壁的完整性息息相关。有研究表明α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与果实的软化有关。Anabf A在构巢曲酶与黑曲霉等真菌中也被广泛研究与表达,而在核盘菌中目前还未见有关α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶相关功能影响的报道。本实验以构巢曲霉中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的蛋白序列作为种子序列,在核盘菌基因组中进行搜索,得到了一个高度同源的序列sscle_04g034810并且将此基因命名为SsAna,并在核盘菌基因组中克隆了编码α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的基因SsAna全序列,构建了原核表达载体p GEX-Ana与瞬时表达载体PCNFe GFP-Ana;通过基因融合的方式获得了敲除载体RH-SsAna,得到两个纯合转化子A1与A2;观察基因SsAna在核盘菌中的功能影响,主要结果如下:(1)敲除突变体A1与A2菌株失去产生菌核的能力,无法产生菌核,并且敲除突变体A1与A2菌株生长速率明显低于野生型1980菌株。(2)在胁迫环境下生长,敲除突变体A1与A2菌株对于过氧化氢(H2O2)和刚果红(Congo Red)很敏感。(3)在烟草、番茄与油菜的离体叶片的致病力检测上,敲除突变体A1与A2菌株的病斑明显小于野生型1980的病斑。(4)敲除突变体A1与A2菌株的菌丝生长分支异常。(5)使用烟草浸润的瞬时表达方法以及蛋白生物学信息分析,进行亚细胞定位实验,发现该蛋白是一个分泌蛋白,并且定位于细胞膜上。(6)通过原核表达后蛋白纯化发现蛋白容易降解,并且酶活性在65℃时反应时间为30 min时最高。本实验结果表明基因SsAna可能参与了核盘菌菌核的形成,同时也影响着菌丝的生长速度与致病力的强度,但具体的分子机理还需要进一步的实验研究。
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