论文部分内容阅读
目的：本研究通过观察不同剂量的加减补阳还五汤对被动型Heymann肾炎大鼠Podocin、Nephrin表达的影响，从而明确加减补阳还五汤对膜性肾病大鼠是否具有治疗效果，并探讨其可能存在的作用机制。
方法：将36只SFP级雄性健康SD大鼠，进行随机分组，分别为正常组、模型组、盐酸贝那普利组（0.16mg/ml）、加减补阳还五汤高（7.04g/ml）、中（3.52g/ml）、低(1.76g/ml）剂量组，每组6只。除正常组大鼠尾静脉注射按照其体重6ml/kg的生理盐水，其余5组大鼠按照其体重6ml/kg尾静脉注射抗近端小管刷状缘抗原（Anti-Fx1A），所有大鼠在造模7天后测量24h尿蛋白定量（24hurinaryprotein，24hUP），24hUP大于10mg者代表造模成功，造模成功后予以灌胃。盐酸贝那普利组及加减补阳还五汤高、中、低剂量组分别采用盐酸贝那普利片、加减补阳还五汤高、中、低剂量浓缩液进行灌胃，正常组和模型组则用以等量生理盐水灌胃，每日早晚灌胃各1次，共给药28天。每组大鼠别于给药前及给药后第7、14、28天放入代谢笼留取24h尿液，记录尿量，尿液经离心后取上清液用以检测24hUP；给药28天后予以处死大鼠，从心脏取血，用血液检测血白蛋白（albumin，Alb）、血胆固醇（Totalcholesterol，TC）、血甘油三脂（Triglyceride，TG）、血肌酐(serumcreatinine,SCr)和尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)。取肾脏组织分别行苏木素-伊红染色（HE染色）、马松三色染色法（Masson染色）、过碘酸六胺银染色（PASM染色），肾脏组织病理的改变在光镜显微镜下观察；同时采用免疫荧光染色法观察IgG和C3在肾小球的阳性表达情况；采用免疫组织化学染色法观察Podocin在肾小球的阳性表达情况；采用实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-timefluorescencequantitativepolymerasechainreaction，Rt-PCR）检测PodocinmRNA、NephrinmRNA在肾皮质的表达量。
结果：
（1）造模7天后，所有造模组大鼠均出现大量的蛋白尿，24hUP均大于10mg/d，并且随机2只造模大鼠透射电镜检查示上皮下电子致密物形成，表明被动型Heymann肾炎大鼠模型的成功建立。
（2）24小时尿蛋白定量结果：在给药7天后，模型组和各个给药组较正常组24hUP明显的升高(P＜0.05),且模型组和各个给药组组间24hUP差异无明显统计学意义（P＞0.05）；在给药14天后，加减补阳还五汤高剂量组24hUP较模型组明显的下降（P＜0.05）,其余各个给药组24hUP与模型组无统计学差异（P＞0.05）。给药28天后各给药组24hUP较模型组降低（P＜0.05）,加减补阳还五汤低、中剂量组与盐酸贝那普利组24hUP差异无明显统计学意义(P＞0.05),加减补阳还五汤高剂量组较盐酸贝那普利组24hUP减少（P＜0.05）。
（3）血生化指标结果：各组间血白蛋白、血总胆固醇、血甘油三酯、血肌酐、血尿素氮的差异无明显统计学意义（P＞0.05）。
（4）肾脏组织病理结果：在HE染色中，正常组的肾组织没有明显异常的变化，而其余大鼠的肾小球可见体积增大，基底膜轻度增厚及毛细血管襻轻微僵硬，系膜细胞的轻度增生，并可见大多数肾小管上皮细胞呈空泡变性，偶有刷状缘脱落；在Masson染色中，正常组大鼠的肾组织无病理改变，在模型组大鼠的肾小球基底膜上皮下可见散在的嗜复红蛋白沉积，盐酸贝那普利组及加减补阳还五汤高、中、低剂量组较模型组其上皮下嗜复红蛋白沉积减少，其中加减补阳还五汤高剂量组大鼠其上皮下嗜复红蛋白沉积最少；在PASM染色中，正常对照组大鼠肾组织未见明显病理学改变，模型组大鼠肾小球上皮下可见散在“钉突”形成，与模型组相比，盐酸贝那普利组及加减补阳还五汤高、中、低剂量组大鼠肾小球上皮下“钉突”形成减少，其中加减补阳还五汤高剂量组的“钉突”数最少。
（5）免疫荧光检测肾小球IgG、C3阳性表达情况：在正常组大鼠的肾小球中未发现IgG和C3的阳性表达，其为阴性（－），其余各造模组大鼠的肾小球中均发现IgG和C3沿着毛细血管壁以细颗粒状形式沉积。其中模型组大鼠肾小球两者阳性表达呈（＋＋＋），盐酸贝那普利组和加减补阳还五汤低剂量组大鼠肾小球两者阳性表达呈（＋＋），加减补阳还五汤中剂量组大鼠肾小球其两者阳性的表达呈（＋），而加减补阳还五汤高剂量组大鼠肾小球两者阳性的表达呈（＋－）。
（6）免疫组化测Podocin在肾小球中的表达情况：对Podocin的阳性表达区域进行半定量分析，与正常组相比较，模型组、盐酸贝那普利组及加减补阳还五汤高、中、低剂量组大鼠肾小球Podocin的阳性表达量明显下降（P＜0.05）；与模型组相比较，中药高剂量组Podocin的表达量增加（P＜0.05）,中药中、低剂量组与盐酸贝那普利组的Podocin的阳性表达量升高，但差异不显著（P＞0.05）；与盐酸贝那普利组相比较，中药高剂量组Podocin的表达显著增加（P＜0.01），而中药中、低剂量组Podocin的阳性表达量差异无明显统计学意义（P＞0.05）。
（7）实时荧光定量PCR检测Podocin、NephrinmRNA结果：与正常组比较，盐酸贝那普利组、模型组及加减补阳还五汤低、中剂量组大鼠肾组织中PodocinmRNA、NephrinmNephrin的表达量显著降低（P＜0.01），加减补阳还五汤高剂量组两者的表达均升高（P＜0.05）；与模型组比，4组给药组两者表达均升高（P＜0.01）；与盐酸贝那普利组相比较，加减补阳还五汤低剂量组两者的表达下降（P＜0.01）,加减补阳还五汤中剂量组NephrinmRNA的表达下降（P＜0.05）,PodocinmRNA的表达下降但差异无统计学意义（P＞0.05），而加减补阳还五汤高剂量组两者的表达量均升高（P＜0.01）。其中，中药中剂量组较中药低剂量组两者表达升高，但无明显统计学差异（P＞0.05）。
结论：
1、加减补阳还五汤可以减少膜性肾病大鼠24h尿蛋白定量；
2、加减补阳还五汤可以减轻膜性肾病大鼠肾小球上皮下免疫复合物的沉积；
3、加减补阳还五汤可能通过上调肾组织PodocinmRNA、NephrinmRNA的表达，维持肾脏滤过屏障稳定，从而达到治疗效果；
4、加减补阳还五汤高剂量对膜性肾病大鼠的治疗效果优于加减补阳还五汤中、低剂量，其疗效可能与剂量成正比。
方法：将36只SFP级雄性健康SD大鼠，进行随机分组，分别为正常组、模型组、盐酸贝那普利组（0.16mg/ml）、加减补阳还五汤高（7.04g/ml）、中（3.52g/ml）、低(1.76g/ml）剂量组，每组6只。除正常组大鼠尾静脉注射按照其体重6ml/kg的生理盐水，其余5组大鼠按照其体重6ml/kg尾静脉注射抗近端小管刷状缘抗原（Anti-Fx1A），所有大鼠在造模7天后测量24h尿蛋白定量（24hurinaryprotein，24hUP），24hUP大于10mg者代表造模成功，造模成功后予以灌胃。盐酸贝那普利组及加减补阳还五汤高、中、低剂量组分别采用盐酸贝那普利片、加减补阳还五汤高、中、低剂量浓缩液进行灌胃，正常组和模型组则用以等量生理盐水灌胃，每日早晚灌胃各1次，共给药28天。每组大鼠别于给药前及给药后第7、14、28天放入代谢笼留取24h尿液，记录尿量，尿液经离心后取上清液用以检测24hUP；给药28天后予以处死大鼠，从心脏取血，用血液检测血白蛋白（albumin，Alb）、血胆固醇（Totalcholesterol，TC）、血甘油三脂（Triglyceride，TG）、血肌酐(serumcreatinine,SCr)和尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)。取肾脏组织分别行苏木素-伊红染色（HE染色）、马松三色染色法（Masson染色）、过碘酸六胺银染色（PASM染色），肾脏组织病理的改变在光镜显微镜下观察；同时采用免疫荧光染色法观察IgG和C3在肾小球的阳性表达情况；采用免疫组织化学染色法观察Podocin在肾小球的阳性表达情况；采用实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-timefluorescencequantitativepolymerasechainreaction，Rt-PCR）检测PodocinmRNA、NephrinmRNA在肾皮质的表达量。
结果：
（1）造模7天后，所有造模组大鼠均出现大量的蛋白尿，24hUP均大于10mg/d，并且随机2只造模大鼠透射电镜检查示上皮下电子致密物形成，表明被动型Heymann肾炎大鼠模型的成功建立。
（2）24小时尿蛋白定量结果：在给药7天后，模型组和各个给药组较正常组24hUP明显的升高(P＜0.05),且模型组和各个给药组组间24hUP差异无明显统计学意义（P＞0.05）；在给药14天后，加减补阳还五汤高剂量组24hUP较模型组明显的下降（P＜0.05）,其余各个给药组24hUP与模型组无统计学差异（P＞0.05）。给药28天后各给药组24hUP较模型组降低（P＜0.05）,加减补阳还五汤低、中剂量组与盐酸贝那普利组24hUP差异无明显统计学意义(P＞0.05),加减补阳还五汤高剂量组较盐酸贝那普利组24hUP减少（P＜0.05）。
（3）血生化指标结果：各组间血白蛋白、血总胆固醇、血甘油三酯、血肌酐、血尿素氮的差异无明显统计学意义（P＞0.05）。
（4）肾脏组织病理结果：在HE染色中，正常组的肾组织没有明显异常的变化，而其余大鼠的肾小球可见体积增大，基底膜轻度增厚及毛细血管襻轻微僵硬，系膜细胞的轻度增生，并可见大多数肾小管上皮细胞呈空泡变性，偶有刷状缘脱落；在Masson染色中，正常组大鼠的肾组织无病理改变，在模型组大鼠的肾小球基底膜上皮下可见散在的嗜复红蛋白沉积，盐酸贝那普利组及加减补阳还五汤高、中、低剂量组较模型组其上皮下嗜复红蛋白沉积减少，其中加减补阳还五汤高剂量组大鼠其上皮下嗜复红蛋白沉积最少；在PASM染色中，正常对照组大鼠肾组织未见明显病理学改变，模型组大鼠肾小球上皮下可见散在“钉突”形成，与模型组相比，盐酸贝那普利组及加减补阳还五汤高、中、低剂量组大鼠肾小球上皮下“钉突”形成减少，其中加减补阳还五汤高剂量组的“钉突”数最少。
（5）免疫荧光检测肾小球IgG、C3阳性表达情况：在正常组大鼠的肾小球中未发现IgG和C3的阳性表达，其为阴性（－），其余各造模组大鼠的肾小球中均发现IgG和C3沿着毛细血管壁以细颗粒状形式沉积。其中模型组大鼠肾小球两者阳性表达呈（＋＋＋），盐酸贝那普利组和加减补阳还五汤低剂量组大鼠肾小球两者阳性表达呈（＋＋），加减补阳还五汤中剂量组大鼠肾小球其两者阳性的表达呈（＋），而加减补阳还五汤高剂量组大鼠肾小球两者阳性的表达呈（＋－）。
（6）免疫组化测Podocin在肾小球中的表达情况：对Podocin的阳性表达区域进行半定量分析，与正常组相比较，模型组、盐酸贝那普利组及加减补阳还五汤高、中、低剂量组大鼠肾小球Podocin的阳性表达量明显下降（P＜0.05）；与模型组相比较，中药高剂量组Podocin的表达量增加（P＜0.05）,中药中、低剂量组与盐酸贝那普利组的Podocin的阳性表达量升高，但差异不显著（P＞0.05）；与盐酸贝那普利组相比较，中药高剂量组Podocin的表达显著增加（P＜0.01），而中药中、低剂量组Podocin的阳性表达量差异无明显统计学意义（P＞0.05）。
（7）实时荧光定量PCR检测Podocin、NephrinmRNA结果：与正常组比较，盐酸贝那普利组、模型组及加减补阳还五汤低、中剂量组大鼠肾组织中PodocinmRNA、NephrinmNephrin的表达量显著降低（P＜0.01），加减补阳还五汤高剂量组两者的表达均升高（P＜0.05）；与模型组比，4组给药组两者表达均升高（P＜0.01）；与盐酸贝那普利组相比较，加减补阳还五汤低剂量组两者的表达下降（P＜0.01）,加减补阳还五汤中剂量组NephrinmRNA的表达下降（P＜0.05）,PodocinmRNA的表达下降但差异无统计学意义（P＞0.05），而加减补阳还五汤高剂量组两者的表达量均升高（P＜0.01）。其中，中药中剂量组较中药低剂量组两者表达升高，但无明显统计学差异（P＞0.05）。
结论：
1、加减补阳还五汤可以减少膜性肾病大鼠24h尿蛋白定量；
2、加减补阳还五汤可以减轻膜性肾病大鼠肾小球上皮下免疫复合物的沉积；
3、加减补阳还五汤可能通过上调肾组织PodocinmRNA、NephrinmRNA的表达，维持肾脏滤过屏障稳定，从而达到治疗效果；
4、加减补阳还五汤高剂量对膜性肾病大鼠的治疗效果优于加减补阳还五汤中、低剂量，其疗效可能与剂量成正比。