肿瘤微环境抑制因素导致抗肿瘤免疫的主力军——T淋巴细胞在肿瘤组织浸润减少、功能异常。痘病毒是一种溶瘤病毒,可以感染肿瘤细胞,诱导免疫原性细胞死亡,激活抗肿瘤免疫应答。细胞因子IL-7可以促进初始T细胞增殖和分化,增强效应性T细胞功能,延长记忆性T细胞存活时间,抑制Treg细胞功能,从而增强抗肿瘤免疫应答。采用IL-7基因改造痘病毒形成的重组病毒,可以激活并增强抗肿瘤免疫应答,促进效应性T细胞向肿瘤浸润并增强其功能。本课题拟采用小鼠IL-7基因编码序列修饰痘病毒,构建IL-7重组痘病毒,通过实验性治疗小鼠结直肠癌模型,探讨IL-7重组痘病毒的治疗效果,以期为肿瘤免疫治疗提供新思路。第一部分 构建稳定表达萤火虫荧光素酶的小鼠结直肠癌细胞株并构建荷瘤小鼠模型目的:建立稳定表达萤火虫荧光素酶的小鼠结直肠癌基因转染细胞株,并采用此细胞株构建荷瘤小鼠模型。方法:以慢病毒为载体,采用脂质体转染法将含萤火虫荧光素酶基因的质粒pLVX-Puro-Luc2P导入MC38细胞,经嘌呤霉素加压筛选获得基因转染细胞株。采用RT-PCR技术和化学发光法分别从基因水平和蛋白水平鉴定基因转染细胞株萤火虫荧光素酶的表达。采用基因转染细胞株构建小鼠荷瘤模型,检测基因转染细胞株成瘤能力,绘制成瘤曲线并观察小鼠体内基因转染细胞的生物发光强度。结果:RT-PCR技术确定基因转染细胞含有萤火虫荧光素酶mRNA。化学发光法确定基因转染细胞含有有活性的萤火虫荧光素酶。基因转染细胞株成瘤率达100%,小鼠活体成像技术可以检测到生物发光,确定基因转染细胞株小鼠肠癌模型构建成功,并将此细胞株命名为MC38-Luc。结论:成功构建了稳定表达萤火虫荧光素酶的基因转染细胞株MC38-Luc,并采用该细胞株成功构建了小鼠肠癌模型。第二部分 IL-7重组痘病毒对小鼠结直肠癌模型治疗作用的研究目的:探讨IL-7重组痘病毒对小鼠结直肠癌模型的治疗作用。方法:扩增鼠IL-7基因编码序列,将目的基因和载体质粒pCMS1-IRES进行双酶切并连接,获得IL-7重组质粒。将IL-7重组质粒和痘病毒进行同源重组,获得IL-7重组痘病毒,并扩增和纯化。采用RT-PCR技术和ELISA法分别从基因水平和蛋白水平确定IL-7重组痘病毒IL-7的表达。检测IL-7重组痘病毒的增殖能力和杀伤能力。采用IL-7重组痘病毒治疗MC38-Luc荷瘤小鼠,绘制肿瘤生长曲线和荷瘤小鼠生存曲线。对完全缓解的荷瘤小鼠,再接种MC38-Luc细胞和B16-F10细胞,观察小鼠肿瘤生长情况。结果:成功构建了 IL-7重组痘病毒,该病毒可以延缓荷瘤小鼠肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期,诱导特异性持久性的抗肿瘤免疫应答。结论:IL-7重组痘病毒可有效治疗小鼠肠癌模型。