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犊牛大肠杆菌性腹泻是由产肠毒素性大肠杆菌引起的一种消化道传染病,表现为剧烈腹泻、脱水甚至死亡,给养牛业带来严重的经济损失。临床上抗生素的不规则使用,加剧了细菌的耐药性,耐药菌株不断增多,耐药谱越来越广。目前该病主要采用不同地区大肠杆菌优势毒力因子制成的多价疫苗和敏感药物进行防治。因此,开展犊牛腹泻大肠杆菌的毒力基因和耐药性调查,对防治大肠杆菌性犊牛腹泻具有重要的现实意义。本研究内容包括大肠杆菌肠毒素基因多重PCR方法的建立、毒力基因检测和耐药性调查3个方面。多重PCR检测方法的建立。本研究参照文献合成4对扩增大肠杆菌estA (229bp)、estB (480bp)、elt-Ⅰ(605bp)和elt-Ⅱ(300bp)基因片段的特异性引物,通过对反应条件的优化、敏感性和特异性试验及临床样品检测,建立了检测大肠杆菌肠毒素基因的多重PCR方法。该方法稳定、特异、敏感,最低检出量分别为2.55×101CFU/μL、2×101CFU/μL和2.47×103CFU/μL。毒力基因的检测。从黑龙江省哈尔滨市、阿城、牡丹江、北安、肇东、克东等地区12个奶牛场共采集131份犊牛腹泻粪便样本,共分离到342株大肠杆菌；采用常规和多重PCR方法,对大肠杆菌黏附因子(K88、K99、987p、F1、F41、F17、F18、saa、CS31A、afaE-8)、毒素(estA、estB、elt-Ⅰ、elt-Ⅱ、Stx1、Stx2、EAST1、afaD-8)、毒力岛(eaeA、ler、irp2、 hlyA、sepA、ETT2)编码基因和肠出血性大肠杆菌0157、H7抗原基因进行了检测。结果显示,121株大肠杆菌携带毒力基因,有63株至少携带一种黏附因子,其中F17(44/121)的检出率最高,其次是K88(12/121)、CS31A(13/121)、afaE-8(10/121)和saa(2/121),没有检测到K99、987P、F41和F18菌毛；毒素基因以EAST1(41/121)、irp2(37/121)检出率最高,其次是ler (12/121、afaD-8(10/121)、elt-Ⅱ (8/121)、eaeA(6/121)、hlyA(5/121)、 Stx1(5/121)、estA (4/121)、Stx2(4/121)和sepA (1/121); H7抗原检出11株,未检出0157抗原、elt-I和estB基因。耐药性调查。采用kirby-Bauer琼脂扩散法对分离到的121株携带毒力基因的大肠杆菌进行了药物敏感性试验,结果显示,受试大肠杆菌对14种常用抗生素表现出不同程度的耐药性。受试菌对氨苄西林、阿米卡星和诺氟沙星的耐药率最高,分别为73.55%、71.90%和60.33%;阿莫西林、庆大霉素、头孢噻肟、头孢拉定则相对敏感,敏感率分别为79.34%、76.86%、71.07%和70.25%。受试菌多重耐药现象严重,3重以上耐药的菌株占受试菌的65.29%(79/121),其中16株受试菌为10重以上耐药。本研究建立了大肠杆菌肠毒素多重PCR检测方法,掌握了黑龙江省犊牛腹泻大肠杆菌主要毒力基因的流行情况和耐药性,为大肠杆菌性犊牛腹泻的快速诊断和防治提供了科学方法和实验依据。