急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是临床上常见的急腹症之一,其起病急、病情重、并发症多、死亡率高。常常合并肺、肝、肾、肠道等胰外器官损伤,其中以肺损伤最为常见。关于AP肺损伤的发病机制目前仍不十分清楚,认为与胰酶活性、细胞因子与炎性介质、氧化应激、微循环障碍等多种因素有关。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是一组与水通透性有关的细胞膜转运蛋白。至今在哺乳动物体内已发现13种AQPs(AQP0~AQP12),其中分布于肺组织的有6种(AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9)。有研究表明,AQP5与淡水溺水、内毒素肺损伤、高氧肺损伤、急性呼吸窘迫综合征的发病机制有关,并可影响支气管的收缩,参与哮喘的发生和腺体的分泌。由于急性肺损伤的主要病理变化之一是肺水肿,目前关于肺损伤与AQPs关系的研究较多。已有研究表明,AP合并肺损伤时,肺组织AQP1表达减少,在mRNA水平和蛋白表达水平均明显下降,说明AQP1表达减少在AP肺水肿发生中发挥了重要作用,地塞米松(dexamethasone, DEX)可通过抑制炎症介质、提高AQP1表达来改善AP肺损伤,但未见关于AP合并肺损伤时AQP5表达变化的相关研究。目的:本研究通过建立大鼠AP模型,并给予DEX干预,观察肺组织的病理改变、肺湿/干重比、动脉血氧分压(PaO2)变化及AQP5在肺组织的表达情况,探讨DEX对AP大鼠肺AQP5表达的影响。方法:1动物模型的制备:选取Wistar雄性大鼠,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,取上腹正中切口进入腹腔,以无创动脉夹夹闭近肝门端胰管,然后用加工钝头1ml注射器于十二指肠乳头附近逆行插入胰管,以0.2 ml/min速度注入5%牛磺胆酸钠(1 ml/Kg),推药后以左手拇指捏闭胰管入十二指肠处,观察3 min,去除动脉夹,关腹。2实验分组:将雄性Wistar大鼠54只,随机分为假手术组( SO组,n=18)、急性胰腺炎组( AP组,n=18)、地塞米松治疗组( DEX组,n=18),后又以不同时间点3 h、6 h、12 h分为三个亚组,每个亚组6只大鼠。其中DEX组于造模后立即腹腔注射DEX (5mg/kg)。3血气分析:取动脉血约1 ml,立即送往河北医科大学第二医院呼吸内科血气分析室测定动脉血气。4肺组织湿/干重比:取左肺叶,以滤纸吸净表面液体,称取湿重,置于60°C烤箱烘烤72 h至恒重,称取干重,然后计算湿/干重比。5血清淀粉酶的检测:取血清样本,采用全自动血清生化分析仪,由河北医科大学第二医院生化室协助测定。6肺和胰腺组织学检查:采用石蜡切片,HE染色。7免疫组织化学染色:石蜡切片脱蜡至水,3 %过氧化氢孵育20 min,抗原热修复,山羊血清封闭30 min,滴加一抗4°C过夜,阴性对照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各30 min,后用3,3-二氨基苯联胺(DAB)显色,复染后封片。以细胞膜呈现黄褐色颗粒为阳性表达。8 Western blot: 250 mg肺组织用玻璃匀浆器彻底粉碎,加入1 ml lysis buffer,充分裂解,提取AQP5膜蛋白(具体操作按说明书),取100μg与上样缓冲液充分混合,置于SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳,转移至PVDF膜,以5%脱脂奶粉封闭2 h,一抗4°C孵育过夜,二抗室温孵育2 h。ECL发光显色。结果:1大鼠胰腺的病理学变化:大体和光镜观察所见,SO组胰腺及其周围组织结构大致正常;AP组和DEX组随着时间的推移,胰腺组织水肿、出血、坏死及炎性细胞浸润的程度逐渐加重,腹水量也逐渐增多。2大鼠肺脏的病理学变化:大体和光镜观察所见,SO组肺组织结构大致正常;AP组随着时间的推移,肺组织水肿、出血、炎性细胞浸润程度逐渐加重;而DEX组肺组织损伤程度较AP组明显减轻。3血清淀粉酶的变化:在各个时间点,SO组淀粉酶无显著变化,AP组和DEX组与SO组相比,淀粉酶均明显升高(P<0.05)。与AP组相比,DEX组淀粉酶在6 h和12 h明显降低(P<0.05),在3 h时间点两组无明显差异。4肺组织湿/干重比的变化:在各时间点,SO组肺组织湿/干重比无明显变化,AP组和DEX组与SO组相比均明显升高(P<0.05)。与AP组相比,DEX组在各时间点肺组织湿/干重比均明显降低(P<0.05)。5动脉血氧分压(PaO2)的变化:在各时间点,SO组无明显差异。与SO组比较,AP组和DEX组在各时间点PaO2均明显降低(P<0.05)。与AP组比较,DEX组在各时间点PaO2均明显升高(P<0.05)。6 AQP5免疫组化检测:SO组肺组织中AQP5在肺泡上皮细胞和细支气管表层上皮细胞表面有强烈的表达。AP组肺组织AQP5表达较SO组明显减弱(P<0.05)。DEX组较AP组明显增强(P<0.05)。7 AQP5 Western blot:SO组肺组织AQP5表达在各个时间点无明显差异。与SO组相比,AP组与DEX组肺组织AQP5表达在各个时间点均明显减少(P<0.05)。与AP组相比,DEX组肺组织AQP5表达在各个时间点均明显增强(P<0.05)。结论:1逆行胰管内注射5%牛磺胆酸钠,检测发现血清淀粉酶升高,HE染色发现胰腺水肿、出血和坏死,肺组织水肿、充血、出血和炎性细胞浸润,另外肺湿/干重比明显增加、PaO2明显下降,综上说明大鼠AP模型制备成功,AP大鼠伴有肺损伤。2 AP肺损伤时肺脏AQP5表达降低,提示AQP5在肺脏的水液平衡中起作用,在AP肺损伤中是一种保护蛋白。3在应用DEX治疗后AQP5表达上升,肺损伤减轻,说明DEX可通过调节AQP5表达来改善AP相关肺损伤。