目的:嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum,Ap)是一种专性细胞内寄生的以蜱为传播媒介的革兰氏阴性菌,能导致人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)。HGA是一种可致命的新型传染性疾病,已在世界范围内流行,成为威胁公众健康的重要公共卫生问题。为探究Ap的致病机制,本研究第一部分通过生物信息学方法筛选出35个Ap Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system,T4SS)潜在效应蛋白,克隆、表达及纯化了其中8个蛋白及Ap外膜蛋白P44,并制备了相应的多克隆抗体;为进一步鉴定效应蛋白是否依赖T4SS,分别构建了traG-virD4和5’-cat-loxp-tet融合基因,化学合成了cre基因片段,以期为后续建立T4SS效应蛋白报告系统奠定基础。本研究第二部分利用血清学筛查的方法对17个Ap种属特异性蛋白开展相关研究,旨在发现可提高HGA诊断灵敏度的新型抗原。方法:一、嗜吞噬细胞无形体T4SS潜在效应蛋白的基因克隆、原核表达和鉴定1.Ap T4SS潜在效应蛋白的筛选、基因克隆、原核表达、纯化及抗体制备1.1生物信息学方法筛选Ap T4SS潜在效应蛋白利用生物信息学技术,以Ap基因组编码的610个未知功能蛋白为靶标,根据Ap T4SS潜在效应蛋白的共同特征(种属特异性、蛋白羧基末端带电情况、GC含量和Coiled-coil结构域等),筛查Ap T4SS潜在效应蛋白。1.2 Ap T4SS潜在效应蛋白原核表达载体的构建根据Gene Bank中各效应蛋白的基因序列,设计含有DNA限制性内切酶位点和6×His标签序列的特异性引物,以Ap基因组DNA为模板,PCR扩增各潜在效应蛋白的基因序列。将扩增的目的基因和原核表达载体pET28a(+)或pGEX-4T-1分别用DNA限制性内切酶双酶切,酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下定向连接后转化至感受态细菌E.coli TOP10中,提取质粒测序,将阳性质粒转化至感受态细菌E.coli BL21(DE3)中,保藏菌种。1.3 Ap T4SS潜在效应蛋白的原核表达及纯化将含重组质粒的E.coli BL21(DE3)在37 ~oC培养,加入IPTG诱导潜在效应蛋白表达并采用镍柱亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE电泳检测各重组蛋白的表达水平及纯度。1.4多克隆抗体的制备以纯化的潜在效应蛋白为抗原,免疫健康的ICR小鼠,10周后通过心脏采血的方式收集小鼠血清,制备各潜在效应蛋白的多克隆抗体,Western Blot检测各多克隆抗体的特异性。2.Ap T4SS效应蛋白CRAFT系统的前期构建Ap作为胞内菌,目前无合适的基因修饰方法,其T4SS效应蛋白的鉴定需要依赖于报告系统在替代宿主中进行。本研究拟借助大肠杆菌作为替代宿主,构建CRAFT系统(Cre reporter assay for translation)以检测依赖T4SS的Ap效应蛋白。该系统由供体菌(E.coli S17-1 lamp pir)和受体菌(E.coli K-12 MG1655)构成接合体系,主要包括转运通道,偶联蛋白和报告基因三部分。转运通道为供体菌的T4SS;偶联蛋白为TraG氨基端和VirD4羧基端构成的融合蛋白TraG-VirD4,后者可捕捉Ap效应蛋白并传递至供体菌的T4SS;报告基因由Cre重组酶与效应蛋白的融合基因cre-aph和抗生素融合基因5’-cat-loxp-tet-loxp-cat-3’构成,两组融合基因分别克隆于供体菌和受体菌中。导入5’-cat-loxp-tet-loxp-cat-3’的受体菌由于cat插入失活,仅表现出Tet抗性。若效应蛋白依赖于T4SS,则其融合蛋白Cre会随其分泌至受体菌,介导Lox P位点两端的cat重组,使受体菌转变为Cat抗性。最终通过受体菌的抗性转变鉴定Ap潜在效应蛋白是否依赖T4SS。2.1构建融合基因traG-virD4根据traG基因序列设计含有DNA限制性内切酶位点(Mfe I+Pci I)的特异性引物,以E.coli S17-1 lamp pir的基因组DNA为模板,PCR扩增traG。根据virD4基因序列设计含有DNA限制性内切酶位点(Pci I+BamH I)的特异性引物,以Ap的全基因组DNA为模板,PCR扩增virD4。利用连接PCR构建重组基因traG-virD4。进一步将连接产物克隆至pMAL-c5x载体并转化至供体菌。2.2化学合成cre基因化学合成cre基因片段,后期进一步扩增各效应蛋白基因aph后构建融合基因cre-aph,并将其导入供体菌。2.3构建融合基因5’-cat-loxp-tet根据5’-cat基因序列设计4对特异性引物(上游引物与cat的5’端序列匹配,下游序列含有LoxP(34 bp)位点及tet 5’端的匹配序列),以质粒pACYC184为模板,PCR扩增5’-cat-loxp。根据cat-3’基因序列设计4对特异性引物(上游引物包含LoxP位点及tet 3’端的匹配序列,下游引物与cat的3’端序列匹配),以质粒pACYC184为模板,PCR扩增loxp-cat-3’。根据tet基因序列设计1对特异性引物,以质粒pACYC184为模板,扩增tet。利用连接PCR构建重组基因5’-cat-loxp-tet,进一步将loxp-cat-3’基因连接至5’-cat-loxp-tet基因。二、人粒细胞无形体病新型诊断抗原的鉴定为寻找HGA的新型诊断抗原,对生物信息学技术筛选出的17个Ap种属特异性蛋白(APH1153、Ats-1、APH1127、APH0812、APH0847、APH1067、APH0653、APH1384、APH1345、APH1386、APH0832、APH0615、APH1235、APH1157、APH0261、APH1068、APH0833)开展以下研究。1.Ap阳性血清的鉴定以Ap外膜蛋白P44为抗原,通过Western Blot技术从600份临床标本中筛查阳性血清,并通过免疫荧光技术(IFA)对其中部分阳性血清进行鉴定。2.强抗原性特异性重组蛋白的鉴定利用已鉴定的Ap阳性血清通过Western Blot技术从17个Ap种属特异性蛋白中筛选强抗原性的重组蛋白;应用100份临床血清分析筛查到的强抗原性重组蛋白与P44的血清差异性反应。3.多肽的合成及其抗原性验证应用生物信息学在线软件Antibody Epitope Prediction(http://tools.immune epitope.org/tools/bcell/iedb_input)中的Kolaskar&Tongaonkar Antigenicity程序预测P44、APH1384和APH0812的抗原表位,在北京赛百盛公司化学合成多肽抗原。应用Dot Blot技术,检测多肽与阳性血清的反应,同时分析APH1384多肽与P44多肽的血清差异性反应。4.APH0812片段的分段克隆、表达、纯化及抗原表位的鉴定由于前期合成的APH0812多肽抗原不与阳性血清反应,为确定抗原表位的分布,本研究分段克隆、表达并纯化APH0812片段(APH0812-1、APH0812-2、APH0812-3、APH0812-4、APH0812-4-5)(各片段的氨基酸序列范围见附表)通过检测各片段与阳性血清的反应以鉴定抗原表位的分布。附表APH0812各片段的氨基酸序列范围效应蛋白APH0812APH0812-1 APH0812-2 APH0812-3 APH0812-4 APH0812-4-5氨基酸范围258-490258-318298-358338-398378-438378-4904.1分段克隆、表达并纯化APH0812根据Gene Bank中aph0812的基因序列,设计含有DNA限制性内切酶位点和6×His标签序列的5对aph0812特异性引物,以Ap的全基因组DNA为模板,PCR扩增aph0812各基因片段。将目的基因克隆至原核表达载体pMAL-c5x并转化至感受态细菌E.coli DH5α中,测序正确后,保藏菌种。将含重组质粒的E.coli BL21(DE3)于37 ~oC培养,加入IPTG诱导蛋白的表达,SDS-PAGE检测蛋白表达水平。采用镍柱亲和层析的方法纯化APH0812的各蛋白片段。4.2 APH0812抗原表位的初步鉴定利用Western Blot技术检测APH0812各蛋白片段与阳性血清的反应,从而确定APH0812抗原表位的分布。在线软件Antibody Epitope Prediction预测APH0812-4-5蛋白片段(氨基酸全长:378-490)的多肽表位,分别包括以下氨基酸片断:APH0812(365-389),APH0812(395-416),APH0812(450-485)。由北京赛百盛公司重新合成APH0812-4-5蛋白片段的3段多肽序列,利用Dot Blot技术检测其与阳性血清的反应。结果:一、嗜吞噬细胞无形体T4SS效应蛋白的基因克隆、原核表达和鉴定1.Ap T4SS潜在效应蛋白的筛选、基因克隆、原核表达、纯化及抗体制备1.1生物信息学方法筛选Ap T4SS潜在效应蛋白通过生物信息学方法筛选出35个Ap T4SS潜在效应蛋白,对其中8个潜在效应蛋白(APH1153、APH0819、APH1384、APH1386、APH1235、APH1068、APH1157、APH1345)和Ap外膜蛋白P44进一步作后续研究。1.2 Ap T4SS潜在效应蛋白的基因克隆、原核表达及纯化菌落PCR鉴定及测序结果显示各潜在效应蛋白及p44的基因片段均克隆至pET28a(+)。SDS-PAGE电泳检测结果显示各重组潜在效应蛋白均表达,且大小与预期一致。1.3多克隆抗体的制备用纯化的潜在效应蛋白免疫健康的ICR小鼠10周后,获取血清,Western Blot检测结果显示,制备的多克隆抗体均可与相应效应蛋白特异性结合。2.Ap T4SS效应蛋白CRAFT系统的前期构建2.1构建融合基因traG-virD4PCR鉴定和测序结果显示,融合基因traG-virD4已成功构建。进一步将连接产物克隆至pMAL-c5x载体上。2.2化学合成cre基因测序结果显示,cre基因片段已化学合成。进一步将连接cre与aph基因片段。2.3构建融合基因5’-cat-loxp-tetPCR鉴定和测序结果显示,融合基因5’-cat-loxp-tet已成功构建。PCR结果显示,loxp-cat-3’基因序列已扩增。进一步将loxp-cat-3’连接至5’-cat-loxp-tet,以构建融合基因5’-cat-loxp-tet-loxp-cat-3’。二、人粒细胞无形体病新型诊断抗原APH1384及APH0812的鉴定1.Ap阳性血清的鉴定Western Blot技术筛查出若干份P44阳性血清;IFA的检测结果进一步确定阳性结果。2.强抗原性特异性重组蛋白的鉴定Western Blot检测结果显示,Ap阳性血清筛查到5个抗原性较强的特异性重组蛋白,分别为APH1127、APH0812、APH0847、APH1067和APH1384。利用100份临床血清进一步从5个蛋白中筛查到2个与P44血清反应差异蛋白,分别为APH1384和APH0812,二者与P44可协同检测Ap阳性血清,提高HGA诊断的灵敏度。3.多肽的合成及其抗原性验证在线软件预测并合成P44、APH1384和APH0812的多肽序列,Dot Blot技术检测各多肽与阳性血清反应,结果显示P44及APH1384多肽与阳性血清反应明显,而APH0812多肽与阳性血清未见明显反应,且APH1384多肽与P44多肽的血清反应有差异。4.APH0812片段的分段克隆、表达、纯化及抗原表位的鉴定4.1分段克隆、表达并纯化APH0812菌落PCR结果显示,APH0812-1、APH0812-2、APH0812-3、APH0812-4、APH0812-4-5均克隆至载体pMAL-c5x中。SDS-PAGE电泳结果显示,APH0812的5个片段均表达且大小与预期一致。4.2 APH0812抗原表位的初步鉴定Western Blot结果显示,APH0812-4、APH0812-4-5与阳性血清反应明显,但利用Dot Blot检测结果显示,新合成的3段位于APH0812-4-5片段的多肽与阳性血清均无明显反应,结果提示APH0812的抗原表位可能存在于APH0812-4-5片段的其他区域。结论:1.本研究克隆、表达及纯化了8个Ap T4SS潜在效应蛋白及外膜蛋白P44,并制备了相应的多克隆抗体,为后期研究Ap T4SS效应蛋白的生物学功能提供重要工具。2.本研究构建了traG-virD4和5’-cat-loxp-tet融合基因,并化学合成了cre基因片段,为后期构建CRAFT系统以进一步鉴定效应蛋白是否依赖T4SS奠定了基础。3.本研究从Ap种属特异性蛋白中鉴定出2个强抗原性蛋白(APH1384和APH0812),有望作为HGA的新型诊断抗原。