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植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的一类酶，将其添加到单胃动物植物性饲料中，可以释放植酸中的无机磷以及被植酸络合的Ca2+、Mg2+、Zn2+等矿物元素和一些蛋白质，从而解除植酸抗营养作用、提高动物饲料的营养价值，同时也减少了动物粪便中植酸磷的含量，降低了磷对环境的污染程度。研究表明，饲料中添加植酸酶可使其中磷利用率提高60％，粪便中磷排出量减少40％，还可以提高饲料转化率，改善动物的生产性能，因此对提高养殖业的经济效益及环境保护均具十分重要意义。 植酸酶主要存在于微生物和植物中，动物体内也有少量存在，但真正具有开发价值的主要是微生物产生的植酸酶，尤其是曲霉产生的酸性植酸酶。国外早在1991年就成功地利用DNA重组技术获得第一株酸性植酸酶的工程菌，并已投入商品化生产。目前已开始从事植酸酶的植物和动物基因工程的研究，已成功将植酸酶基因导入苜蓿、烟草、小鼠和猪的唾液腺中。国内对植酸酶的研究起步较晚，到目前为止，植酸酶野生菌株产酶水平低下的问题仍然没有得到彻底解决，目前市场上应用的植酸酶制剂多属进口产品，且价格昂贵。因此，提高植酸酶野生菌株产酶水平，降低其生产成本，对实现植酸酶产品国产化并获取自己专利具有十分重要意义。而提高野生菌株产酶水平的主要思路集中在通过基因工程手段克隆植酸酶基因或进行适当改造，然后将这些优良基因导入适当的宿主菌，进一步筛选出高产工程菌株，优化发酵工艺条件从而实现植酸酶基因的高效表达。 因此，本实验着力于将已构建的可进行诱导调控分泌表达的毕赤酵母整合型表达载体转化毕赤酵母受体菌，进而筛选出高产稳产植酸酶的工程菌，为植酸酶的规模化生产提供优良菌种，并对工程菌株的产酶培养基进行初步优化从而为规模化生产提供科学依据。主要实验结查如下：西南农业大学硕士学位论文 1、用乃aI酶切携带植酸酶基因表达片段的重组质粒pPICgK夕句)A，回收DNA，用GenePulser电击转化毕赤酵母，涂布MD平板，又用含不同浓度G418的YPD平板进行抗性筛选，得到98个可检测到植酸酶活力的阳性转化子，它们在MD、MM平板上均表现快速生长，说明其甲醇利用表型是Mut干。用特异性引物，对转化菌株进行PcR检测，扩增出了特异条带，表明外源基因整合进了宿主细胞。挑选转化子经过BMGY摇瓶培养、BMMY诱导发酵后，用钒铝酸按法测定了表达产物的酶活性，结果表明重组菌株可有效表达具有生物学活性的植酸酶。经摇瓶复筛后得到l株产酶活性为143958.3UZmL发酵液，并且具有良好遗传稳定性的高产工程菌株（E22），其产酶活性是出发菌株酶活性（422U/mL）的341 .13倍。 2、重组酵母E一22在诱导培养168h之内，植酸酶的表达随时间的延长而增加，到144h接近高峰，之后基本保持稳定。菌体湿重在诱导培养72h之内有所增加，随后基本保持稳定。重组植酸酶部分酶学性质的研究结果表明:重组酶在pH值2.5一3.0和5.0一5.5时酶活性最高，且在pH4.5一6.5之间均有较高的酶活性，最适作用温度为55℃。sDs一PAGE的结果显示重组植酸酶的分子量介于70kDa97kDa之间。重组植酸酶粗酶比活力为461575.8 u/mg。 3、用5因素的均匀设计试验对工程菌株的产酶培养基进行了初步优化，酵母提取物、甲醇、蛋白陈、YNB、生物素在培养基中的浓度分别取2%，4%，1%，0，0.0001%;在此条件下发酵液的酶活力达到108758.3 U/mL发酵液，高于均匀设计中各试验点的酶活力值，是使用BMMY培养基同条件（诱导培养96h，37℃测酶活）下酶活力（97666.7U/mL）的1 1 1.4%。