一、研究背景和目的流感病毒为单股负链RNA病毒,属于正黏液病毒科,呈球形或丝状,直径80-120nm,病毒由三层构成,内层为病毒核衣壳,含核蛋白(NP)和RNA,中层为病毒囊膜,由一层类脂体和一层膜蛋白(M)构成,M蛋白抗原性稳定,也具有型特异性,外层为两种不同糖蛋白构成的辐射状突起,即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。根据HA和NA抗原的不同,又可分为许多亚型,H可分为16个亚型,N有9个亚型(N1～N9)。其中H1N1、H2N2.H3N2和2009年流行的新甲型H1N1主要感染人类,其它亚型的自然宿主主要是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株,并且一旦感染人类也是属于高致病性的,一旦发生变异而具有人与人的传播能力,也会导致人间禽流感的流行。流感病毒的抗原性变异主要是指HA和NA抗原结构的改变,在亚型内部经常发生小变异,即抗原漂移(antigenic drift),几年可发生一次大的抗原变异,出现新的亚型即抗原转换(antigenic shift),当HA和NA都发生了大的变异,并由此产生新的亚型可引起世界性大流行。在二十世纪就有三次大流行,一是1918年西班牙流感,由H1N1亚型流感病毒所引起,这次流感造成全世界2000-4000万人死亡,成为人类传染病历史上最大的灾难。二是1957年亚洲型流感,它由H2N2亚型流感病毒所引起,是人与禽流感病毒基因重组的结果。三是1968年香港型流感,由H3N2亚型流感病毒引起,为人与禽流感病毒的重组。从近年全球及国内的流行病学调查分析可以看出,H3N2亚型在大多数国家是流感流行的优势毒株,我国也以甲型(H3N2)和乙型Victoria为优势株。仅1968-1992年间我国发生的10次流感小流行中就有7次都是由H3N2亚型流感病毒所引起,并且在1998年和2002年我国也都发生了较大范围的H3N2亚型流感流行,其中北京市1998年11-12月的人群总发病率高达10%,总发病人数达到了100万以上。2005年广东省流感未发生大的流行,但局部暴发疫情仍比较活跃,并且主要分布在中小学校,以A(H3N2)亚型流感病毒为优势株暴发疫情。在我国2011-2012年流感监测中,H3N2亚型流感病毒2012年在南方省份引起了小规模的暴发。我国的人口基数大,也是流感高发地区,并且流感的新变种多次均首发于华南地区,属于流感发病多发中心。广东省流感病原学监测的结果分析可发现近年的优势株均有H3N2亚型。流感病毒一直在人群中流行的主要因素是病毒的主要抗原不断地发生变异,从而逃离宿主的免疫识别,不断地引发新的流行。流感病毒最主要的两个抗原是HA和NA蛋白,也是研究领域热点,通过HA和NA基因序列和氨基酸序列的分析,了解深圳市流感病毒进化规律,为流感预防工作提供科学依据。二、研究方法1、2007-2011年深圳市H3N2亚型人群感染情况和血清抗体水平分析(1)流感监测网络深圳市流感监测网络组成：由深圳市疾病预防控制中心(CDC)和所辖八个区CDC,主要负责流感样病例及门诊、急诊就诊病例总数等数据收集、流感病毒的分离鉴定和暴发疫情处理工作。监测医院有深圳市第一人民医院、深圳市妇幼保健院和八辖区区人民医院,同时在八辖区各选择一个社区健康服务中心,完成流感样病例数及就诊病例总数等资料收集。选择一所大学、中学和小学作为学校监测点和两所敬老院作为老年人群监测点,进行流感样病例、就诊病例总数数据收集。监测单位于每周一将上周监测数据通过网络或传真方式报告市CDC。(2)流感样病例的采集：监测医院于每周一或周四采集发病3天以内、且没有服用过抗病毒药物的流感样病例的鼻咽拭子标本,同时收集流感样病例的基本资料和临床资料等信息。所采集标本应在24小时内冷藏(4-8℃)运送至辖区CDC实验室进行检测和病毒分离。(3)一般人群流感抗体水平调查采样对象指一周内无上呼吸道感染症状的人群。采用随机整群抽样法,具体操作方法为：对深圳八辖区各区的街道办分别进行编号,应用随机数字表赋予每个街道办一个随机数；并预先规定的随机数最大的街道办即为所选街道办,若有两个街道办同时获得相同的最大随机数,则重新赋予其随机数再次进行抽取。各区CDC于流感流行期前后即3、9月份,在各区所选街道办内完成0-、5-、15-、25-、60-五个年龄段人群的血清的采集；每个区的每个年龄段至少采集30份,各街道办采样点应不少于3个。采用红细胞凝集抑制实验(HAI)方法检测人群流感病毒血清抗体。用SPSS13.0分析血清抗体阳性结果。2、2007-2011年深圳市H3N2亚型的HA、NA基因变异分析(1)引物设计合成H3N2亚型流感病毒的HA和NA片段分别从Genbank上下载10-20条不等的序列利用DNAstar匕对整理后,使用软件Primer Primer5.0进行HA、NA片段的引物设计,并由宝生物工程(大连)有限公司合成。(2)扩增HA、NA基因采用美国罗氏公司的试剂盒High Pure Viral RNA Kit提取病毒RNA,采用One Step RT-PCR DRR024A试剂盒对病毒HA、NA基因片段进行PCR扩增,并用1%琼脂糖凝胶鉴定PCR产物,置于凝胶成像系统分析仪下观察有特异性条带出现的将PCR产物送宝生物大连有限公司进行测序。(3)序列分析用BioEdit进行核酸序列比对,Mega5.0以标准株A/HongKong/1/1968的HA、NA基因作为基准序列,进行核苷酸进化分析,并构建进化树。以标准株A/Brisbane/10/2007HA、NA基因作为参考序列进行氨基酸变异分析。3、病毒H3N2免疫小鼠的抗血清分析(1)免疫小鼠：选取4-6周龄的小鼠,将灭活的H3N2病毒与等量的弗氏不完全佐剂混合并乳化完全,按200μg/只剂量经皮下注射小鼠,一周后,用相同剂量的H3N2流感病毒抗原与等量弗氏完全佐剂混合完全乳化后进行加强免疫。一周后,摘取眼球取血,静置1小时,3000rpm离心20分钟,小心吸取上清于EP管中,放置-20℃保存备用。(2)交叉血抑测定和抗原比计算,抗原比(R)计算公式如下：r1=甲血清对乙抗原的血抑滴度/甲血清对甲抗原的血抑滴度r2=乙血清对甲抗原的血抑滴度/乙血清对乙抗原的血抑滴度R(抗原比)=(r1*r2)1/2三、结果1、2007-2011年的H3N2阳性率和人群血清抗体阳性率深圳市疾病预防控制中心2007-2011年流感样病例占门诊急诊病例的百分率(ILI%)分别为6.66%(151890/2278884)、5.91%(159592/2696653)、7.06%(221552/3137273)、5.43%(160774/2959464)、4.69%(147298/3138229)。其中H3N2亚型的核酸阳性人数分别为174、50、479、42、29,H3N2亚型的核酸阳性率分别为6.9%、1.5%、9.3%、1.0%、0.8%。2007年分别与2008、2009、2010年的血清抗体平均阳性率比较、2011年分别与2008、2009、2010年的血清抗体平均阳性率比较差异均有统计学意义；2007年与2011年血清抗体平均阳性率比较、2008年与2009年血清抗体平均阳性率比较差异均无统计学意义。2、序列结果(1)HA序列分析结果五年季节H3N2的HA基因在不断的变异,进化基本按时间顺序逐步演化,但是2007年和2008年在进化树上有出现交替过渡时期。其中,A/HongKong/1/1968基因与A/Shenzhen/330/2011基因同源性最小(85.8%),与A/Wuhang/359/1995基因同源性最大(90.6%)。标准株A/Brisbane/10/2007的HA基因与深圳市2007-2011年的毒株同源性分别为98.5%-99.6%、98.6%-99.2%、98.6%-98.7%、97.4%-98.2%、97.9%-98.2%。2007-2011年主要置换的位点包括P210L,2008年氨基酸置换的位点还包括S140N/R、E174K、K189E/N/Q、Q372R/T、I390L、D505N,2009年的还包括E78K、N160K、K189Q、N205K、V229A、I377R、2010年包括D69N、E78K、Y110H、N160K、Y177S、K189Q、T228A、I246V、I371K,2011年的包括Q49R、S61N、T63I、E78K、N160K、K189Q、V239I、R271G、G272X、N294K、D307X、N328S。(2)NA序列分析结果五年的季节性H3N2的NA基因和HA基因进化相似。NA基因核苷酸序列同源性中,HongKong/1/1968基因与A/Shenzhen/13/2011基因同源性最小(86.9%),与A/Wuhang/359/1995基因同源性最大(91%)。标准株A/Brisbane/10/2007毒株NA基因与2007-2011年同源性分别为98.7%-99.6%、98.5%-99.5%、98.5%～99%、97.9%～99%、98.2%～98.6%2007-2011年主要置换的位点包括D147N、I194V、T312I、2008年氨基酸置换的位点还包括I215V,2009年的还包括V349X,2010年的还包括S367N、K369T,2011年的还包括L81P、D93G、G257X、N402D。3、2007年、2009年和2011年毒株间相互的抗原比在2007年、2009年及2011年分离到的毒株里各选择一株毒株免疫小鼠后进行交叉血凝抑制实验,根据血抑测定结果用抗原比计算公式得出其毒株之间的抗原比,A/shenzhen/84/2007与A/shenzhen/360/2009、A/shenzhen/218/2011之间的抗原比都为2.8,说明A/shenzhen/84/2007与其两株毒株间抗原有较小的差异,而A/shenzhen/360/2009与A/shenzhen/218/2011的抗原比为1.4,说明两毒株间抗原无明显差异。四、结论本研究通过设计引物扩增H3N2亚型的HA、A基因片段,利用生物信息学软件BioEdit和Mega5.0对序列进行分析,HA、NA基因序列都有存在一些变异,2007年与标准株A/Brisbane/10/2007的HA和NA同源性最高,依次逐年降低。82株主要氨基酸变异位点有2008年HA基因的A区位S140N/R, B区位K189E/N/Q,D区位E174K;2009-2011年B区位的N160K、K189Q,E区位E78K。而人群血清抗HA抗原抗体2007与2011年抗体阳性率分别为69.4%、64.5%,差异无统计学意义。2008和2009年人群抗体分别为40.4%和38.4%,差异无统计学意义,但与2007或2011年的人群血清抗体阳性率两两比较差异有统计学意义。2009年HA基因的五个抗原决定簇位点高度变异,而A/shenzhen/84/2007与A/shenzhen/360/2009、A/shenzhen/218/2011之间的抗原性有较小的差异,人群较低的抗体水平与H3N2病毒亚型流行可能相关。