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1.用 IS-PCR 和 rep-PCR 法分析了 17 份分离自云南滇西高原粳稻区的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae )和 7 个其它地区的水稻白叶枯病菌的群体遗传多样性。 2 个适合中国水稻白叶枯病菌的引物 J3 和 ERIC 对这 24 个菌系基因组 DNA 进行 PCR 扩增反应, J3 引物有 14 条条带,ERIC 引物有 13 条条带,2 个引物呈现 18 种谱型。用 PHYLIP Version 3.6 软件 UPGMA 聚类分析法分析白叶枯病菌系之间的遗传距离, 可将 24 个病原菌分为 4 簇,3 个来自菲律宾的白叶枯病菌与中国的菌系距离较远,云南高原粳稻区分离的菌系十分复杂,4个簇中都有,但主要集中在两个簇中,共有 14 个菌系。 2.菲律宾白叶枯病菌株 PXO339 是 9a 生理小种的代表菌株,它对Xa7,Xa4,Xa10 和 Xa14 等抗病基因表现毒性,而对隐性抗病基因 xa5 表现无毒。从 PXO339 中克隆到一个新的无毒基因,全长 2118bp, 编码 705 个氨基酸,分子量和等电点分别为 74.7 kDa 和 6.585。NCBI 网站 BLAST 表明,该基因属于AvrBs3 基因家族,命名为 arp3(AvrBs3 related protein)。与所有 AvrBs3 基因家族成员的基因序列Alignment 分析发现,Arp3的N-端缺少了两个长度分别是144bp和 45bp 的片断。进一步研究发现,在水稻白叶枯病菌中,Arp3N-端的特征很普遍,都缺少这两个片断。全长的 arp3 基因中间序列是一个特异的 5.5 次 102 bp的重复区(Repeats),是目前已经克隆的 AvrBs3 基因家族所有成员中重复次数最少的一个。C-端有 3 个核定位信号(Nuclear localization signals, NLSs)和 1 个酸性转录激活域(Acidic transcriptional activation domain, AAD)。核定位信号对无毒蛋白进入植物细胞核是必要的,缺少了核定位信号或者酸性转录激活域,无毒蛋白会失去毒性。由此推测,AvrBs3 相似蛋白是一个组装的蛋白,是病原细菌和植物长期互相竞争中形成的。中间的重复区,是无毒蛋白的基本功能域,N-端和 C-端结构是无毒蛋白用来武装自己,使自己能顺利从细菌内分泌出去,到达植物细胞并表现正常功能。 Southern 分析发现该基因在 PXO339 基因组中单拷贝存在,而且只位于PXO339 的质粒 DNA 上,推测它可能是一个候选的 avrxa5 基因。利用 pGEX-4T-1原核表达载体,构建 pGEX-4T-1-Arp3 融合表达蛋白,Western 分析表明,Arp3能正常表达,表达的融合蛋白大小为 128 kDa。融合表达载体通过电击转化到毒性很强的菲律宾白叶枯病菌株 PXO99,剪叶接种含有 xa5 抗病基因的水稻近等基因系材料 IRBB5。与对照(接种 PXO99)相比,接种 PXO99::pGEX-4T-1-Arp3的 IRBB5 没有明显地表现为抗病,只是比对照的病情稍轻,但是表现为感病。 I<WP=4>复旦大学博士学位论文 水稻白叶枯病菌无毒新基因的功能鉴定以及 Quorum Sensing 相关基因的克隆和表达因此,arp3 基因可能是一个候选的 avrxa5 基因。3.从白叶枯病菌中克隆到两个 Quorum Sensing (QS)相关的同源基因。xooR是一个转录因子,全长 765 bp;相邻的 amino acid transporter(aat)基因是一个跨膜蛋白,全长 1377bp。Southern 分析表明,这两个基因单拷贝存在基因组中。利用原核表达载体 pET-24a-d (+)构建融合表达载体,EGFP 基因标记,跨膜蛋白 aat基因在膜上表达;Western 分析显示 XooR-GFP 融合蛋白大小为 54kDa,表达在细胞液中某一特定区域,PCR 方法删除 XooR N-段前 8 个和 42AA 后在整个胞液中都表达,表明 XooR 的 N-端前面的一些氨基酸有重要的定位信号。