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目的: 随着我国风湿热发病率下降及老龄化加剧，退行性钙化性主动脉瓣膜病(DCAVD)成为老年人最常见的心脏瓣膜病。目前DCAVD已成为我国老年人心衰、晕厥甚至猝死的主要病因之一，尚无有效药物能预防或延缓其进展，手术仍是最有效的治疗手段，这给患者家庭及社会带来了巨大经济负担。探讨DCAVD发病机制，从而及时有效的干预其进展，将具有极大的经济价值和社会价值。 既往认为DCAVD是退行性钙磷沉积不可逆的被动过程，近年来研究表明DCAVD是类似成骨样分化受多因素调控的主动过程，涉及慢性炎症反应、脂代谢异常及钙盐沉积等。至今，DCAVD发病机制仍不清楚，有待进一步研究。 Mohler等已分离出瓣膜间质细胞(VICs)，并证实其在特定条件下可转化为成骨细胞样细胞，并形成钙结节。研究证实主动脉钙化瓣膜中成骨细胞和骨组织的标志物表达升高，如碱性磷酸酶、骨钙蛋白、骨桥蛋白等，提示钙化相关因子可能参与DCAVD发病过程，VICs向成骨细胞分化可能是DCAVD发病的重要基础。microRNAs是细胞内重要的非编码调控分子，可参与调控多种生理和病理过程。VICs结合miRNA是研究DCAVD发病机制的一个新视角，存在为DCAVD提供早期诊断及治疗的潜在价值。 本研究采用miRNA芯片技术筛选出调控DCAVD相关的miRNAs，从中选取miRNA-449c-5p作为研究对象，进一步验证其功能，通过RT-PCR、Western blot等技术探讨其调控机制，以期阐明DCAVD发病机制，寻找其早期诊断及干预措施。 感染性心内膜炎(IE)是指心脏内膜微生物感染，可伴赘生物形成，近年来发病率呈上升趋势。关于活动期IE手术时机及效果的选择目前仍存在争议，传统上多倾向于内科治疗，即手术多在正规有效抗感染4-6周，体温正常，血培养阴性后进行，但在此期间，易发生心功能不全、栓塞等，病死率较高。本研究拟通过分析活动期IE血培养及药敏结果，为合理选择抗生素提供依据，并进行长期随访，以探讨早期手术疗效。 方法: 第一部分 1、差异miRNAs筛选及目标miRNA确定:对瓣膜钙化组织和相对正常组织提取RNA，通过miRNA芯片技术测定miRNA表达情况，筛选出差异miRNAs，从差异miRNAs中选取miRNA-449c-5p作为研究对象，通过RT-PCR技术验证其差异表达。 2、VICs培养和鉴定:术中留取人正常主动脉瓣膜，采用改进的胶原酶消化法获取VICs，并对VICs进行细胞表型鉴定。 3、差异性表达miRNA-449c-5p的功能验证:将miRNA-449c-5p mimics、inhibitor和negative control分别导入VICs，模拟过表达和低表达miRNA-449c-5p，进行转染效率测定，然后进行成骨诱导，在7天和14天进行RT-PCR、Western blot、ALP活性测定及茜素红染色，验证miRNA-449c-5p对VICs成骨分化的影响。 4、miRNA-449c-5p调控VICs成骨分化的机制:通过miRNA专业靶基因预测网站，初步预测miRNA-449c-5p靶基因，再通过双荧光素酶实验，验证两者结构匹配程度，最后通过SiRNA技术验证靶基因的真实性。 5、VICs成骨诱导中，IL-6对miRNA-449c-5p的调控作用:首先，收集VICs成骨诱导前和诱导后24h、48h的培养基，检测其IL-6浓度;其次，VICs培养基中，加入IL-6对其刺激，分别于加入前和加入后24h、48h收集细胞，行miRNA-449c-5p测定。 6、动物实验:将miRNA-449c-5p agomirs、antagomirs及negative control分别经尾静脉注射入Balb/c小鼠体内，分别过表达和低表达miRNA-449c-5p，然后皮下注射Vitamin D3诱导软组织钙化，6周后行心脏超声检测。 第二部分 回顾性分析2010年5月至2014年7月我院收治的62例活动期IE患者血培养结果及临床资料，所有患者均早期外科治疗，术后长期随访。 结果: 1、成功筛选出DCAVD相关的差异miRNAs，并从中选取miRNA-449c-5p作为研究对象; 2、成功分离出VICs，并对其表型进行了鉴定，证实其达到体外实验要求; 3、对miRNA-449c-5p进行功能研究，动物水平、细胞水平、蛋白水平和mRNA水平研究显示，miRNA-449c-5p能够调控VICs成骨分化; 4、通过靶基因专业预测网站，预测miRNA-449c-5p靶基因为Smad4，通过双荧光素酶报告实验，确定Smad4为其靶基因，最终确定miRNA-449c-5p通过TGF-β/Smad通路调控VICs成骨分化; 5、证实VICs成骨分化中，分泌型IL-6表达上调，而IL-6刺激VICs可导致其miRNA-449c-5p表达下调，从而证实DCAVD发病中IL-6可能调控miRNA-449c-5p的表达; 6、活动期IE主要病原菌为链球菌、粪肠球菌和金葡菌，围术期死亡2例，余60例治愈出院，57例术后长期随访心功能Ⅰ级42例，Ⅱ级15例，随访期均无IE复发。 结论: 1、筛选出DCAVD特异性miRNA表达谱; 2、miRNA-449c-5p靶基因为Smad4，通过TGF-β/Smad信号通路在体内外水平调控VICs成骨分化; 3、IE病原菌以革兰氏阳性菌为主，需根据药敏结果合理选择抗生素，早期手术治疗活动期IE临床疗效满意。