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前言: 人类CARMA3基因定位于22q13.1,CARMA3又称为凋亡蛋白酶募集结构域和膜相关鸟苷酸激酶样结构域蛋白3,属于CARMA3家族,该家族的蛋白是支架蛋白,它有CARMA1(CARD11)、CARMA2(CARD14)、CARMA3(CARD10)这三个成员,这三种蛋白有类似的结构基序,有一个N端的CARD结构域,紧接着一个卷曲螺旋结构域,一个SH3结构域和一个C端的鸟苷酸激酶样结构域,但它们有不同的表达模式,CARMA1在造血细胞中表达,CARMA2在胎盘和几种黏膜组织中表达,CARMA3在非造血细胞中表达[1-4]。 已经证实CARMA3在乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肾癌[5-8]等癌组织中呈高表达,并且认为CARMA3与细胞的增殖、侵袭、迁移有关,其发生机制与NF-κB的活化有关[9]。最近研究表明:GPCR、EGFR和PKC诱导的NF-κB活化需要CARMA3这种支架蛋白[9-11],而且几项研究显示:GPCR和PKC诱导的NF-κB活化还需要CARMA3的下游信号元件BCL10和MALT-1的参与[9、11-14],在血管内皮细胞中,PKC使CARMA3与BCL10、MALT-1形成的复合体活化并结合蛋白酶活化受体-1(PAR-1),从而激活Ⅰ-κB激酶复合体,Ⅰ-κB激酶依次磷酸化Ⅰ-κB,导致Ⅰ-κB降解,并且释放出有活性的NF-κ B[15],在癌细胞中结构性地激活NF-κB能抵抗凋亡刺激并且使其增殖和迁移能力增强[16]。然而不同癌细胞通过不同机制激活NF-κB,因此揭示导致NF-κ B活化的不同信号途径可能会为不同癌细胞提供靶向治疗方案。 我们实验室早期研究表明CARMA3在非小细胞肺癌组织中呈高表达,并且其表达与TNM分期、淋巴结转移以及EGFR表达相关,CARMA3促进肺癌细胞增殖、侵袭和迁移,它能通过上调cyclinD1的表达来促进癌细胞增殖[17],但其促进侵袭和迁移的机制还有待进一步研究。本研究主要是探讨CARMA3促进癌细胞侵袭和迁移,抑制其凋亡,并初步认为CARMA3可能通过P38MAPK信号途径调节NF-κB,进而调节肺癌细胞侵袭、迁移和凋亡。这为肺癌的基因治疗提供了一定的参考价值,有助于我们开发针对非小细胞肺癌的靶向治疗药物。 材料与方法: 一、细胞系和细胞培养 由于有我们前期的研究工作,因此选用冻存于液氮中A549和H1299细胞系,经过复苏后,用含有10%的胎牛血清的1640培养基,在37℃,5%C02饱和湿度条件下培养,经过三次传代稳定后,进行转染。 二、细胞瞬时转染和转染效率及浓度的测定 转染前24小时将细胞按适当密度种植于6孔板,采用Lipofectamine2000(Invitrogen,USA)转染试剂进行转染,干扰序列采用广州瑞博生产的干扰试剂,并且按照说明书要求进行实验,24小时后FCM监测转染效率,48小时后终止细胞培养,用于后续实验。采用Real-time PCR和Western blot检测干扰效率。 三、Real-time RT-PCR实验 利用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosysterns)合成特异性的cDNA,总反应体系10μ l(总RNA5μ l),在基因扩增仪(G-Storm,英国)内经过如下循环完成反转录实验过程:42℃,30min;85℃,5min,4℃贮存,次日扩增待用,或-20℃贮存,30天内待用。Real-time PCR在Applied Biosystems7900HT Fast Real-time PCR System(Applied Biosystems,USA)内完成。反应体系20μ l,包括cDNA0.25μ l,按照TaqMan MicroRNA Assays Kit(AppliedBiosystems)优化程序进行扩增,采用相对定量的方法,循环过程如下:95℃,30sec;95℃,15sec;60℃,30sec;40个循环。实验组及对照组均设2次重复。用三次独立样本经过3次独立实验后得到的数据用公式RQ计算进行分析。 四、Western blot蛋白检测 收集经过实验处理的A549和H1299细胞,加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂(在检测磷酸化指标时,还要加入磷酸酶抑制剂)裂解,在冰上裂解20-40min,4℃高速离心机15000rpm,离心15min,提取上清总蛋白。根据蛋白的分子量制备不同浓度的SDS—聚丙烯酰胺凝胶,每空上样量80μ g,常规电泳、转印、封闭,一抗4℃孵育过夜,相应HRP-羊抗鼠/兔IgG二抗/羊IgG二抗室温孵育2h,GAPDH作为内参。Western Lightning(R)-ECL,Enhanced ChemiluminescenceSubstrate(Perkin Elmer,NEL100001EA)检测,显影,UVP图像处理系统采集图像,ImageJ灰度值分析软件进行条带灰度分析。以平均吸光度值INT和信号面积S的乘积代表信号强度,分别算出不同指标和GAPDH的INT x S,用二者的比值显示不同指标的表达水平。 五、Transwell细胞迁移实验 采用的Transwell小室的上下室之间的滤膜孔径为8μ m,细胞转染24h后,以0.25%胰蛋白酶液消化后收集。Transwell小室的上室加入100μ l含有40000个A549/H1299的无血清培养基单细胞悬液,下室加入600μ l含有10%血清的1640培养液,每组设立3个复孔,37℃、5%C02细胞培养箱培养。不同细胞系按不同时间终止培养后,PBS洗涤两次,用棉签小心拭除滤膜上室面的细胞,室温下风干Transwell小室,100%甲醇固定,苏木素染色。将培养小室倒置,在光学显微镜(Leica,德国)下观察、拍照,并且计数每高倍镜视野滤膜底面的平均细胞数。每种细胞进行三次平行实验。 六、流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞经过干扰处理后,在含10%血清的1640培养基加入紫杉醇,使其浓度分别为15μ M和10μ M,在A549和H1299细胞系中分别加入15μ M和10μ M浓度的紫杉醇培养基,培养24小时后,收集细胞,用胰酶消化,轻轻吹打。1000rpm离心5min,弃掉培养基;加入1ml PBS用手弹匀,使细胞重悬移入1.5ml EP管中;用PBS洗两次后,用滤纸吸掉残余的PBS;加入1 x buffer缓冲液195μ l重悬细胞;按照Annexin-Ⅴ—FITC凋亡试剂盒(BD Pharmingen,USA)说明书加入Annexin-Ⅴ5μ l轻轻混匀,静置10min,加入190μ l buffer重悬细胞;再加入10μ l PI,轻轻混匀,静置10min(避光室温下);然后上机检测。 七、统计学数据分析 所有统计数据均应用SPSS13.0进行分析,对Realtime PCR和流式测凋亡实验的平行对照结果采用t检验,以P<0.05为有统计学意义。 实验结果: 1.干扰CARMA3后,肺癌细胞侵袭和迁移能力减弱 2.干扰CARMA3后,能促进肺癌细胞的凋亡 3.干扰CARMA3后能抑制NF-κB的活化,但能促进P38的磷酸化 4.在抑制P38磷酸化后,干扰CARMA3,NF-κB活化增加,肺癌细胞迁移能力增强 5.用BAY11-7082抑制NF-κB活化后,Bcl-2、MMP9、MMP2蛋白表达下降,而Bax蛋白表达增加 结论: 1.CARMA3可能通过调节MMP9和MMP7的表达促进肺癌细胞侵袭和迁移 2.在肺癌细胞中,CARMA3能够抑制细胞凋亡,并初步认为其抑制凋亡与调节BCL2、Bax、Caspase9的表达有关。 3.在肺癌细胞中,CARMA3通过P38 MAPK途径调节NF-κB的活化,NF-κB活化后又能调节MMP9、MMP7、BCL2、Bax和Caspase9的表达,从而调节肺癌细胞的侵袭、迁移和凋亡。