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前言： 人类CARMA3基因定位于22q13.1，CARMA3又称为凋亡蛋白酶募集结构域和膜相关鸟苷酸激酶样结构域蛋白3，属于CARMA3家族，该家族的蛋白是支架蛋白，它有CARMA1(CARD11)、CARMA2(CARD14)、CARMA3(CARD10)这三个成员，这三种蛋白有类似的结构基序，有一个N端的CARD结构域，紧接着一个卷曲螺旋结构域，一个SH3结构域和一个C端的鸟苷酸激酶样结构域，但它们有不同的表达模式，CARMA1在造血细胞中表达，CARMA2在胎盘和几种黏膜组织中表达，CARMA3在非造血细胞中表达[1-4]。 已经证实CARMA3在乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肾癌[5-8]等癌组织中呈高表达，并且认为CARMA3与细胞的增殖、侵袭、迁移有关，其发生机制与NF-κB的活化有关[9]。最近研究表明:GPCR、EGFR和PKC诱导的NF-κB活化需要CARMA3这种支架蛋白[9-11]，而且几项研究显示:GPCR和PKC诱导的NF-κB活化还需要CARMA3的下游信号元件BCL10和MALT-1的参与[9、11-14]，在血管内皮细胞中，PKC使CARMA3与BCL10、MALT-1形成的复合体活化并结合蛋白酶活化受体-1（PAR-1），从而激活Ⅰ-κB激酶复合体，Ⅰ-κB激酶依次磷酸化Ⅰ-κB，导致Ⅰ-κB降解，并且释放出有活性的NF-κ B[15]，在癌细胞中结构性地激活NF-κB能抵抗凋亡刺激并且使其增殖和迁移能力增强[16]。然而不同癌细胞通过不同机制激活NF-κB，因此揭示导致NF-κ B活化的不同信号途径可能会为不同癌细胞提供靶向治疗方案。 我们实验室早期研究表明CARMA3在非小细胞肺癌组织中呈高表达，并且其表达与TNM分期、淋巴结转移以及EGFR表达相关，CARMA3促进肺癌细胞增殖、侵袭和迁移，它能通过上调cyclinD1的表达来促进癌细胞增殖[17]，但其促进侵袭和迁移的机制还有待进一步研究。本研究主要是探讨CARMA3促进癌细胞侵袭和迁移，抑制其凋亡，并初步认为CARMA3可能通过P38MAPK信号途径调节NF-κB，进而调节肺癌细胞侵袭、迁移和凋亡。这为肺癌的基因治疗提供了一定的参考价值，有助于我们开发针对非小细胞肺癌的靶向治疗药物。 材料与方法： 一、细胞系和细胞培养 由于有我们前期的研究工作，因此选用冻存于液氮中A549和H1299细胞系，经过复苏后，用含有10％的胎牛血清的1640培养基，在37℃，5％C02饱和湿度条件下培养，经过三次传代稳定后，进行转染。 二、细胞瞬时转染和转染效率及浓度的测定 转染前24小时将细胞按适当密度种植于6孔板，采用Lipofectamine2000(Invitrogen，USA)转染试剂进行转染，干扰序列采用广州瑞博生产的干扰试剂，并且按照说明书要求进行实验，24小时后FCM监测转染效率，48小时后终止细胞培养，用于后续实验。采用Real-time PCR和Western blot检测干扰效率。 三、Real-time RT-PCR实验 利用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosysterns)合成特异性的cDNA，总反应体系10μ l（总RNA5μ l），在基因扩增仪(G-Storm，英国)内经过如下循环完成反转录实验过程:42℃，30min;85℃，5min，4℃贮存，次日扩增待用，或-20℃贮存，30天内待用。Real-time PCR在Applied Biosystems7900HT Fast Real-time PCR System(Applied Biosystems，USA)内完成。反应体系20μ l，包括cDNA0.25μ l，按照TaqMan MicroRNA Assays Kit(AppliedBiosystems)优化程序进行扩增，采用相对定量的方法，循环过程如下:95℃，30sec;95℃，15sec;60℃，30sec;40个循环。实验组及对照组均设2次重复。用三次独立样本经过3次独立实验后得到的数据用公式RQ计算进行分析。 四、Western blot蛋白检测 收集经过实验处理的A549和H1299细胞，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂（在检测磷酸化指标时，还要加入磷酸酶抑制剂）裂解，在冰上裂解20-40min，4℃高速离心机15000rpm，离心15min，提取上清总蛋白。根据蛋白的分子量制备不同浓度的SDS—聚丙烯酰胺凝胶，每空上样量80μ g，常规电泳、转印、封闭，一抗4℃孵育过夜，相应HRP-羊抗鼠/兔IgG二抗/羊IgG二抗室温孵育2h，GAPDH作为内参。Western Lightning(R)-ECL，Enhanced ChemiluminescenceSubstrate(Perkin Elmer，NEL100001EA)检测，显影，UVP图像处理系统采集图像，ImageJ灰度值分析软件进行条带灰度分析。以平均吸光度值INT和信号面积S的乘积代表信号强度，分别算出不同指标和GAPDH的INT x S，用二者的比值显示不同指标的表达水平。 五、Transwell细胞迁移实验 采用的Transwell小室的上下室之间的滤膜孔径为8μ m，细胞转染24h后，以0.25％胰蛋白酶液消化后收集。Transwell小室的上室加入100μ l含有40000个A549/H1299的无血清培养基单细胞悬液，下室加入600μ l含有10％血清的1640培养液，每组设立3个复孔，37℃、5％C02细胞培养箱培养。不同细胞系按不同时间终止培养后，PBS洗涤两次，用棉签小心拭除滤膜上室面的细胞，室温下风干Transwell小室，100％甲醇固定，苏木素染色。将培养小室倒置，在光学显微镜(Leica，德国)下观察、拍照，并且计数每高倍镜视野滤膜底面的平均细胞数。每种细胞进行三次平行实验。 六、流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞经过干扰处理后，在含10％血清的1640培养基加入紫杉醇，使其浓度分别为15μ M和10μ M，在A549和H1299细胞系中分别加入15μ M和10μ M浓度的紫杉醇培养基，培养24小时后，收集细胞，用胰酶消化，轻轻吹打。1000rpm离心5min，弃掉培养基;加入1ml PBS用手弹匀，使细胞重悬移入1.5ml EP管中;用PBS洗两次后，用滤纸吸掉残余的PBS;加入1 x buffer缓冲液195μ l重悬细胞;按照Annexin-Ⅴ—FITC凋亡试剂盒(BD Pharmingen，USA)说明书加入Annexin-Ⅴ5μ l轻轻混匀，静置10min，加入190μ l buffer重悬细胞;再加入10μ l PI，轻轻混匀，静置10min（避光室温下）;然后上机检测。 七、统计学数据分析 所有统计数据均应用SPSS13.0进行分析，对Realtime PCR和流式测凋亡实验的平行对照结果采用t检验，以P＜0.05为有统计学意义。 实验结果： 1.干扰CARMA3后，肺癌细胞侵袭和迁移能力减弱 2.干扰CARMA3后，能促进肺癌细胞的凋亡 3.干扰CARMA3后能抑制NF-κB的活化，但能促进P38的磷酸化 4.在抑制P38磷酸化后，干扰CARMA3，NF-κB活化增加，肺癌细胞迁移能力增强 5.用BAY11-7082抑制NF-κB活化后，Bcl-2、MMP9、MMP2蛋白表达下降，而Bax蛋白表达增加 结论： 1.CARMA3可能通过调节MMP9和MMP7的表达促进肺癌细胞侵袭和迁移 2.在肺癌细胞中，CARMA3能够抑制细胞凋亡，并初步认为其抑制凋亡与调节BCL2、Bax、Caspase9的表达有关。 3.在肺癌细胞中，CARMA3通过P38 MAPK途径调节NF-κB的活化，NF-κB活化后又能调节MMP9、MMP7、BCL2、Bax和Caspase9的表达，从而调节肺癌细胞的侵袭、迁移和凋亡。