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胎盘滋养层细胞分化是妊娠建立和维持过程中的重要细胞事件。胚胎进入子宫后,依靠其外围的滋养层细胞与子宫内膜识别、黏附,并向子宫内膜浸润,将胚胎牢固地锚定在子宫内。在妊娠过程中,伴随着胚胎的发育,滋养层细胞也发生复杂的分化,一方面形成具有强大激素分泌功能的合体滋养层细胞,另一方面向子宫内膜基质侵润,并通过替代子宫螺旋动脉血管内皮细胞从而改建螺旋动脉,建立胎盘.子宫循环以高效地为胚胎发育提供营养。滋养层细胞分化受到来自母体和胚胎的多种因素的精确调节,其中任何细胞行为调节的失误都将导致严重的妊娠相关疾病,如子痫前期等。 子痫前期是发生在妊娠20周以后、以蛋白尿和高血压为主要临床特征的产科综合症,其发病率约占所有产妇的5-10%,是产科临床上造成严重母儿危害的重要疾病之一。目前普遍认为胎盘早期发育异常,尤其是滋养层细胞分化障碍可能是子痫前期的关键病因。 MicroRNA是一类含有22个核苷酸的非编码小RNA,可在转录后水平对其靶蛋白的表达进行抑制。研究表明,microRNAs可广泛参与细胞增殖、凋亡、分化等行为的调节,但关于microRNA对胎盘功能的调节研究还较少报道。有研究显示子痫前期胎盘中存在差异表达的microRNAs,我们前期利用生物芯片方法,也从重度子痫前期胎盘中筛选出一批差异表达的microRNA,其中miR-195在子痫前期胎盘中呈现最显著的下调趋势,提示这一小分子可能与胎盘功能调节密切相关。我们通过生物信息学分析发现ActivinA和Nodal的共同Ⅱ型受体ActRIlA是miR-195的预测靶基因之一。以往的研究也已发现ActivinA/Nodal信号通路在胎盘滋养层细胞分化过程中发挥重要作用,同时另有报道显示ActRⅡA是子痫前期的易感基因。 基于以上事实,我们提出假设:miR-195可能通过调节靶基因ActRⅡA并影响ActivinA/Nodal信号通路,参与胎盘滋养层细胞功能的调节;miR-195的异常表达可能参与子痫前期病理的发生。 为了证明此假设,本研究以早孕滋养层细胞系HTR8/SVneo为模型,利用双荧光素酶报告分析确定ActRⅡA是否为miR-195的靶基因;过表达或抑制滋养层细胞中的miR-195,研究其对滋养层细胞侵润和增殖功能的影响,并通过ActRⅡA对miR-195功能的“挽救”实验,确定ActRⅡA是否直接参与miR-195对滋养层细胞功能的调节;同时在子痫前期胎盘中分析pri-miR-195,miR-195和ActRⅡA的表达水平的相关性。 研究结果如下:人滋养层细胞HTR8/Svneo中过表达miR-195可以显著降低ActRⅡA基因mRNA和蛋白表达;生物信息学预测ActRⅡA的3’UTR含有两处miR-195的保守性结合序列(BD1和BD2),据此分别构建荧光素酶报告载体及结合位点突变的报告载体,荧光素酶活性分析证实在人滋养层细胞中miR-195可通过结合ActRⅡA基因3‘UTR中502-508序列抑制ActRⅡA的表达。细胞功能分析显示miR-195并不影响滋养层细胞增殖,但可以显著促进滋养层细胞侵润,并增强基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的激活;miR-195对滋养层细胞侵润的作用可被过表达ActRⅡA完全“挽救”,并且miR-195能够明显抑制ActRⅡA配体(ActivinA或者Nodal)作用所引起的Smad2蛋白磷酸化,明确ActRⅡA是miR-195的直接功能靶基因。与正常组相比,重度子痫前期胎盘中pri-miR-195和miR-195表达下调,而ActRⅡA蛋白水平显著上调,二者呈现反向关联。为了深入探讨miR-195在滋养层细胞分化过程中的作用与机制,我们还通过慢病毒感染构建了稳定过量表达或降调miR-195的细胞系,并通过高通量质谱iTRAQ方法筛选滋养层细胞中miR-195的候选靶基因,绘制其功能靶基因谱。 综上所述,本研究阐明在滋养层细胞中miR-195可通过抑制ActRⅡA进而影响ActivinA/Nodal信号通路,参与调节人类滋养层细胞的侵润行为。胎盘中miR-195表达失调可能引起Activin/Nodal通路功能的紊乱,从而参与子痫前期的病理过程。