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绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)是引起绵羊和山羊患非典型性肺炎的病原体，主要感染对象是1-3月龄羔羊。目前，MO已在世界范围内的许多国家造成绵羊和山羊患病，使各地的养羊业受到重创。 本文以绵羊肺炎支原体标准株Y98的基因组为模板，经PCR分别得到P26、P40和HSP70C基因片段。所得的P26和P40基因片段分别与猪肺炎支原体对应基因的同源性达79％和74％，而HSP70C片段则与公布的绵羊肺炎支原体的相应片段完全一致。通过重叠延伸PCR，分别将P26和P40基因片段中的1个和4个编码色氨酸的TGA突变为TGG。构建P26、P40和HSP70C基因的原核表达质粒pET-28a-P26、pET-28a-P40和pET-28a-HSP70C，转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到的阳性重组菌株分别命名BL21(DE3)(pET-28a-P26)、BL21(DE3)(pET-28a-P40)和BL21(DE3)(pET-28a-HSP70C)。阳性重组菌株诱导后的产物经SDS-PAGE检测分别可见，与预期一致，大小分别为26、40和30KD(Ku)的特异性条带，证实3种重组蛋白均得以表达。Western blot结果表明，3种重组蛋白均表现出良好的反应原性。 提取重组菌株DH5α(pET28a-P26)和DH5α(pET28a-P40)的质粒，经BamHⅠ/HindⅢ双酶切后，连接构建P26-P40融合基因的原核表达质粒pET28a-P26-P40，转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到阳性表达菌株BL21(pET28a-P26-P40)。同理构建P26-HSP70C融合蛋白的阳性表达菌株BL21(pET28a-P26-HSP70C)。SDS-PAGE及Western blot证实，BL21(pET28a-P26-P40)和BL21(pET28a-P26-HSP70C)经诱导后可分别表达分子量约为66kD和56kD的目的蛋白，与预期大小一致。表达的P26-P40和P26-HSP70C融合蛋白既以可溶性形式存在，也有以包涵体形式存在的。制备了P26、P40、P26-P40和P26-HSP70C蛋白的基因工程疫苗，并进行动物试验。间接ELISA结果表明:重组蛋白P26、P40、P26-P40和P26-HSP70C均具有很好的反应原性，血清效价分别为:1∶8000、1∶32000、1∶128000和1∶32000。此外，在相同的稀释倍数下，P26-P40融合蛋白免疫的小鼠血清抗体效价显然高于P26和P40蛋白免疫组，说明融合蛋白的免疫原性明显优于单蛋白的免疫原性。P26-HSP70C融合蛋白免疫的小鼠血清抗体效价也比P26蛋白免疫的小鼠血清抗体效价要高，说明HSP70C蛋白发挥了其免疫佐剂功能。上述结果与不同疫苗的保护率效果一致。羔羊免疫试验进一步证实，P26-P40融合蛋白具有良好的免疫原性。以上结果表明，两种抗原的融合蛋白疫苗的免疫效果明显优于单蛋白疫苗的免疫效果;HSP70C蛋白发挥其免疫佐剂作用，使P26-HSP70C融合蛋白的免疫原性明显优于单蛋白的免疫原性。