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研究报道人脐血间充质干细胞(cord blood mesenchymal stem cells,CB-MSCs)具有自我更新和多向分化的潜能,在体外诱导条件下能跨胚层横向分化为神经样细胞,并且具有来源丰富、易于获得、免疫源性弱等特点,为神经系统疾病细胞替代治疗提供了新的种子来源；人羊膜组织为母体与胎儿间的一层生物膜,其直接与神经上皮联系,向羊水中释放神经递质及神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs),在神经系统发育过程中起着重要作用。本研究目的是观察羊膜上皮细胞(amniotic epithelial cells,AECs)分泌的神经营养因子对人脐带血间充质干细胞神经分化的作用,并通过特异性阻断剂 K252a阻断神经营养因子高黏附性受体,鉴定干细胞的神经元及多巴胺能神经元标记物表达的变化,研究神经营养因子诱导人脐带血间充质干细胞的神经分化初步机制。
研究中,采用沉降红细胞、密度梯度离心和贴壁筛选法纯化人脐血间充质干细胞；酶消化和机械分离方法获得人羊膜上皮细胞； ELISA 法检测人羊膜上皮细胞上清中神经营养因子的表达；常规 PCR(RT-PCR)方法检测人脐带血间充质干细胞神经营养因子高黏附性受体 TrkA、TrkB的表达等技术方法。实验分为对照组(CON)、人羊膜上皮细胞条件培养液(amnion epithelia conditionedmedium,ACM)组和阻断剂组(ACM+K252α)。实验结果表明:正常培养的羊膜上皮细胞上清中含有134.27±3.56～145.83±10.66pg/ml 神经生长因子(nervegrowth factor,NGF)和242.31±12.65～263.08±13.46 pg/ml 脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)。人脐血间充质干细胞中也有神经营养因子高黏附性受体TrkA、TrkB的表达。在P1代(passage 1)CB-MSCs中加入三组培养液诱导48小时后,ACM组和ACM+K252α组与对照组(CON)相比常有突起,类似神经细胞样形态的细胞数量增多,尤其是 ACM 组更为显著。统计学分析诱导 48 小时后三组细胞的表面标记物,在 ACM 组中 DAT 阳性率达20.21％。向CB-MSCs中加入外源性神经营养因子高黏附性受体的阻断剂 k252α,诱导 36 小时后,与 ACM 组对比,ACM+K252α 组 CB-MSCs 表达神经元及多巴胺能神经元标记物两组比较无统计学意义,但两组标记物的表达均高于对照组；而诱导48小时后,ACM 组干细胞表达神经元及多巴胺能神经元标记物的比例明显高于 ACM+K252α组,两组比较有统计学意义。基于上述的实验结果,我们推测,随着 ACM 分泌的神经营养因子对 CB-MSCs 诱导时间的延长,会有更多的转录因子参与到 CB-MSCs 神经分化过程中来。
综上所述,本研究我们得出以下结论:
1.羊膜上皮细胞可分泌脑源性神经营养因子和神经生长因子；人脐血间充质干细胞具有神经营养因子高黏附性受体TrkA、TrkB的表达。
2.脐血间充质干细胞可被羊膜上皮细胞条件培养液诱导分化为具有表达神经元及多巴胺能神经元标记物和形态的神经元样细胞。
3.羊膜上皮细胞分泌的神经营养因子与高黏附性受体Trk结合在CB-MSCs神经分化中起重要作用。