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目的:利用高脂饲料喂养小鼠形成高脂血症,研究绞股蓝总皂苷治疗过程中对肝脏免疫相关基因的调控,为绞股蓝总皂苷的作用机制研究奠定基础。方法:1.样本来源于课题组前期动物实验,动物分组如下:雄性C57BL/6J小鼠分为5组,即第一组(普通饮食组(ND)16W)、第二组(高脂饮食组(HFD)16W)、第三组(ND 38W)、第四组(HFD 38W)和第五组(绞股蓝总皂苷组(GP))。第一组和第二组分别给予普通饲料和高脂饲料16周,用于判断模型是否成功。成功后第三组和第四组分别持续给予普通饲料和高脂饲料38W,并于16周期灌胃给予等体积的溶媒对照;第五组持续给予高脂饲料38周,并于第16周期灌胃给予绞股蓝总皂苷,给药剂量为250 mg/kg,每日给药1次。在16周或38周时,取其肝脏组织。2.提取肝脏RNA,由华大基因公司BGISEQ-500测序平台进行测序,原始序列数据参照GRCm38/mm10小鼠基因组进行比对和注释。通过OMIM和NCBI数据库搜索,共筛选出795个免疫相关基因。从表达矩阵中提取基因表达数据,随机筛选6个表达差异的免疫相关基因,采用实时荧光定量PCR验证肝脏免疫相关基因mRNA表达情况。利用热图、PCA和火山图等对mRNA数据矩阵分析,找出差异表达的肝脏免疫相关基因。筛选出显著表达的基因后,以GP/HFD的倍数变化和HFD/ND的倍数变化对差异基因作散点图,找出受绞股蓝总皂苷显著调控的免疫相关基因。3.应用DAVID数据库对差异基因进行KEGG通路分析。4.筛选出高脂饮食组与普通饮食组的差异基因以及绞股蓝总皂苷组与高脂饮食组的差异基因共277个,对其表达值(FPKM)、体重、血糖、血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平进行相关性分析。5.实时荧光定量PCR技术验证转录组基因的表达水平。结果:1.高脂饮食16周时对肝脏免疫相关基因的整体轮廓分析:高脂饮食16周时,795个肝脏免疫相关基因经热图和PCA分析,高脂饮食组与普通饮食组能够完全分开。通过火山图分析,有151个免疫相关基因的表达水平显著变化(P<0.05)。2.绞股蓝总皂苷治疗后对肝脏免疫相关基因的整体轮廓分析:从热图和PCA图能显著将绞股蓝总皂苷组、高脂饮食组和普通饮食组显著区分。利用火山图对喂养普通饲料和高脂饲料的小鼠肝脏免疫相关基因进行分析,共有242个基因显著表达(P<0.05),基因整体呈现上调趋势。给予绞股蓝总皂苷治疗后,共有90个基因显著变化(P<0.05)。发现Il18、Ngf、Cd4、Vnn1、Ephx1、Mtor等31个免疫相关基因受到高脂饮食和绞股蓝总皂苷的显著调控。3.绞股蓝总皂苷显著调控的免疫相关基因KEGG通路分析:高脂饮食16周时,与普通饮食组相比,在高脂饮食作用下差异表达的基因富集于单纯疱疹感染、癌症通路、丙型肝炎、RIG-I样受体信号通路和Toll样受体信号通路等通路。其中RIG-I-样信号受体通路富集的程度最大。给予绞股蓝总皂苷后,与高脂饮食组相比,差异基因显著富集于单纯疱疹感染、甲型流感、Toll样受体信号通路、麻疹等通路。单纯疱疹感染通路富集的基因数量最多,Toll样受体信号通路的富集程度最大。表明绞股蓝总皂苷通过多种通路调控免疫相关基因。4.相关性分析结果显示:LDL-C与TC呈正相关。Il18bp与体重、Cnpy3与TC、H2-Q10与LDL-C、Il18与LDL-C、Il18与血糖等呈正相关。H2-Eb1与Cfp、Fpr1与Cfp、Cd74与H2-Eb1、H2-Aa与H2-Eb1等呈现高度的正相关,Ikbkg与H2-Q10、Ikbkg与Irf5、Prkar1a与Msrb1等呈高度的负相关。部分高度相关的基因富集于同一通路。5.转录组学数据的可靠性验证:在高脂饮食和绞股蓝总皂苷的影响下,Il18、Ngf、Cd4等先显著上调后显著下调(P<0.05);Vnn1、Ephx1和Mtor等先显著下调后显著上调(P<0.05)。实时荧光定量PCR数据一般都遵循转录组学数据趋势。Il8、Ngf、Cd4、Vnn1、Ephx1和Mtor的PCR结果与RNA-seq数据呈正相关,表明转录组学数据可靠。结论:绞股蓝总皂苷在治疗高脂血症的过程中,对Vnn1、Ephx1、Mtor、Il18、Ngf、Cd4等31个免疫相关基因有显著的调控作用,可能是其治疗高脂血症的作用之一。