产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性厌氧菌,可引起人类和动物的多种疾病。该菌主要引起人的气性坏疽和食物中毒,被美国疾病控制和预防中心列为最常见的食源性疾病诱因。在家禽中,产气荚膜梭菌是引起坏死性肠炎——一种对全球家禽业具有重要经济影响的疾病——的关键病原体。IV型菌毛(Type IV pili,TFP)是一种由主要菌毛蛋白掺杂少量次要菌毛蛋白聚合而成的菌体表面纤维状细丝。TFP介导细菌的多种功能,例如滑动运动、生物被膜形成、对宿主细胞的粘附及DNA摄取。其中,TFP依赖性的细胞粘附是产气荚膜梭菌成功定植的第一步,缺乏TFP介导粘附能力的突变株对宿主细胞的粘附能力大幅降低。此外,在TFP的存在下,产气荚膜梭菌可在宿主细胞表面形成生物被膜并增加毒素产生。产气荚膜梭菌溶素O(Perfringolysin O,PFO)是一种胆固醇依赖性溶细胞素,存在于几乎所有产气荚膜梭菌菌株之中。有研究表明,PFO在坏死性肠炎中与产气荚膜梭菌α毒素具有协同作用,并且PFO介导的细胞毒性可能是产气荚膜梭菌在宿主组织中得以存活的重要因素。因此,TFP及PFO有望成为抗产气荚膜梭菌感染的潜在药物靶标。在本研究中,我们首先以产气荚膜梭菌TFP介导的滑动运动试验及PFO介导的溶血活性试验为筛选表型,从天然化合物中筛选并得到了能够同时抑制TFP介导的滑动运动及PFO介导的溶血活性的天然化合物——穗花杉双黄酮。随后,我们通过滑动运动试验、生物被膜形成试验、最小抑菌浓度试验、生长曲线试验、细胞粘附试验详细研究了穗花杉双黄酮对产气荚膜梭菌TFP生物学活性及粘附能力的影响,并在电子显微镜下观察了穗花杉双黄酮处理后菌体表面菌毛的形态。之后,我们通过溶血试验、细胞毒性试验研究了穗花杉双黄酮对PFO生物学活性的影响,并通过分子模拟、点突变试验及寡聚化试验研究了穗花杉双黄酮与PFO相互作用的分子机制。进一步,在体内试验中,我们通过小鼠腿部感染产气荚膜梭菌建立了小鼠气性坏疽模型,检测了穗花杉双黄酮对感染小鼠死亡率、组织中细菌存活率及组织损伤的影响。最后,我们通过对肉鸡感染产气荚膜梭菌建立了坏死性肠炎模型,通过肉鸡肠道胀气情况、出血情况、粪便情况等指标检测了穗花杉双黄酮对坏死性肠炎的治疗效果,并检测了穗花杉双黄酮对肉鸡肠道内梭菌目相对丰度的影响。我们的结果表明:第一,穗花杉双黄酮对产气荚膜梭菌TFP介导的滑动运动及PFO介导的溶血活性具有显著的抑制作用。第二,穗花杉双黄酮在4或16μg/mL的浓度下对产气荚膜梭菌TFP依赖性的滑动运动、生物被膜的形成及粘附至Caco-2细胞能力具有显著的抑制作用,且这一作用不是通过抑菌或杀菌活性实现的。电子显微镜下观察,我们发现穗花杉双黄酮处理后导致产气荚膜梭菌菌体表面菌毛缺失,说明穗花杉双黄酮是一种潜在的TFP抑制剂。第三,穗花杉双黄酮在2或4μg/mL的浓度下可显著抑制PFO介导的溶血活性和对Caco-2细胞的细胞毒性,S190、S193、N199、V375及N377是穗花杉双黄酮与PFO相互作用的关键靶点,对关键氨基酸残基进行点突变后,穗花杉双黄酮对PFO介导溶血活性的抑制作用显著下降。在寡聚化试验中,穗花杉双黄酮能够抑制PFO的寡聚化过程。第四,在小鼠气性坏疽感染模型中,穗花杉双黄酮可以延长感染小鼠的存活时间,降低感染小鼠组织内的细菌存活率,有效地减轻了病理损伤。第五,在肉鸡坏死性肠炎模型中,我们发现通过给予穗花杉双黄酮可以有效缓解产气荚膜梭菌坏死性肠炎引起的肠道胀气、肠壁出血等病理性损伤,并能够降低肠道内厚壁菌门、梭菌纲及梭菌目的相对丰度。总之,我们的结果表明穗花杉双黄酮是一种潜在的TFP抑制剂,其处理后导致产气荚膜梭菌菌体表面TFP缺失,进而显著降低其对宿主细胞的粘附能力。同时,穗花杉双黄酮也是一种PFO抑制剂,可通过靶向PFO的关键氨基酸残基,抑制PFO的寡聚化,从而显著抑制PFO介导的细胞毒性。由于TFP及PFO介导的毒力对于病原菌的致病力具有决定性作用,穗花杉双黄酮对产气荚膜梭菌感染引起的气性坏疽及坏死性肠炎具有良好的保护作用,具有进一步研发的潜力。