背景:脑血管病是临床常见病,因其具有高患病率、高致死率、高致残率和高复发率的特点,极大地危害着人们的健康,已经成为导致死亡和致残的第二位病因。其中缺血性脑血管病占总发病率的80%以上,探索其病理机制及有效的治疗方法是亟待解决的重大课题。早期的脑血管再通是治疗的关键,静脉溶栓和血管内治疗是已经应用于临床的治疗方法,但静脉溶栓的血管再通率低(大血管只有10%-30%),时间窗短(≤4.5小时),仅有不到3%的患者受益。以机械取栓为主的血管内治疗给广大缺血性脑血管病患者带来了福音,但是机械取栓只能处理颅内大血管病变,自2014年9月开始应用,才仅仅3年的时间,且受到医疗条件、医务人员技术水平、发病时间窗等的限制,还不能使大多数人受益。无论哪种方法,其目的都是使血管再通,挽救半暗带,促进血管新生,侧支循环的重建。因此,脑梗死后血管新生的机制及调控因素成为研究的热点。血管新生是指在原来存在的血管基础上通过内皮细胞增殖和分化以芽生或非芽生的形式生成血管。正常情况下血管新生处于平衡状态,平衡异常可导致许多病理现象,例如癌症、黄斑变性、视网膜病变及缺血性疾病。血管新生是一个复杂的过程,需要多重细胞的共同作用,包括内皮细胞,壁细胞,炎性细胞和血细胞,这些细胞参与到细胞粘附、迁移、增殖和分化的过程中,同时也需要不同的细胞因子和生长因子的刺激,例如血管内皮生长因子,胎盘生长因子,血小板衍生生长因子B,转化生长因子B和血管生成素1等。血管新生与炎症过程紧密相连,而炎症过程恰好作为ROS的主要来源。炎症依赖的ROS和血管新生之间功能上的联系在许多疾病扮演着重要的角色,氧化应激以其积极反馈机制发挥着重要的作用。氧化应激被定义为体内氧化系统及抗氧化系统的失衡,和许多血管疾病的病因及结局有关,调节氧化应激可以促进血管新生及组织修复。NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)是细胞氧化应激反应中的重要转录因子,其介导下游多种抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的转录和表达,并已被证实在氧化应激反应性疾病尤其是缺血性脑损伤中选择性表达升高且发挥重要的调节作用。另外,Nrf可以介导缺氧诱导的心脏微血管内皮细胞及结肠癌和胶质细胞癌的血管新生过程;而治疗性血管新生对于提高脑部血液供给及脑损伤后的恢复有至关重要的促进作用。目前虽有研究明确指出Nrf2通过氧化应激途径调控脑损伤相关疾病,但关于Nrf2对缺氧诱导的脑血管内皮细胞血管生成的调控作用尚无报道。目的:观察Nrf2对缺氧诱导的脑微血管内皮细胞增殖、迁移及成血管作用的的影响,进一步探讨Nrf2对缺氧诱导的脑微血管内皮细胞血管新生的机制。方法:选取小鼠脑微血管内皮细胞株b End.3为实验对象,化学合成Nrf2基因的si RNA及阴性对照,通过脂质体转染b End.3细胞,采用Western blot及RT-PCR检测干扰效果。采用缺氧孵箱法成功建立b End.3细胞缺氧模型。实验分为三组:缺氧组,Control si RNA组,Nrf2si RNA组。划痕实验观察Nrf2si RNA对b End.3细胞迁移能力的影响,CCK8实验观察Nrf2si RNA对b End.3细胞增殖能力的影响,Tube Formation实验观察Nrf2si RNA对b End.3细胞血管形成能力的影响。Western blot检测各组缺氧诱导后b End.3细胞VEGF、p-Akt、Akt、ERK、p-ERK、HO-1和ACTIN蛋白表达情况。采用Graphpad Prism 4.0软件进行统计分析,所有数据采用均数±标准差的方式表示,通过单因素方差分析(One-Way ANOVA)后进行Bonferroni事后检验分析组间差异。结果:1、通过Western blot及RT-PCR检测分别对低氧诱导下Nrf2表达水平进行评价,b End.3细胞在缺氧48h时Nrf2蛋白表达明显上调(P<0.01),Nrf2的m RNA水平在b End.3细胞缺氧48h时较24h相比增加了近三倍(P<0.01)。Nrf2蛋白和m RNA表达水平在长期接触缺氧状态72h是下调的。最大的表达出现在48h(P<0.01)。因此,Nrf2表达在内皮细胞适应缺氧的早期上调,并在长期缺氧的反应过程中降低。2、本实验设计合成3条Nrf2si RNA(si RNA-1,si RNA-2,si RNA-3)及1条阴性对照si RNA序列,结果显示Nrf2 si RNA-1中Nrf2的蛋白和m RNA水平最低,与si RNA NC相比,抑制率达到了4倍(P<0.01)。通过Western blot及RT-PCR检测再次证实干扰效果最佳的片段Nrf2 si RNA-1的抑制效果。因此,Nrf2 si RNA-1用于研究Nrf2在b End.3细胞中的作用。我们同时还发现Nrf2在Nrf2-si RNA组的蛋白水平与si RNA NC组相比明显降低(P<0.01)。3、将Nrf2 si RNA或si RNA NC转染到b End.3细胞,测量b End.3细胞迁移率,结果显示低氧诱导的Nrf2 si RNA b End.3细胞迁移率明显降低,与si RNA NC相比(P<0.01),提示Nrf2可促进脑微血管内皮细胞迁移。4、将Nrf2 si RNA或si RNA NC转染到b End.3细胞。经24小时转染后,细胞暴露于缺氧24小时,采用CCK8分析检测细胞活力。结果显示低氧诱导的Nrf2 si RNAb End.3细胞存活率显著降低,与si RNA NC相比(P<0.01),提示Nrf2可促进脑微血管内皮细胞的增殖。5、将Nrf2 si RNA或si RNA NC转染到b End.3细胞,并引入Matrigel中形成小管。结果显示,在缺氧诱导的b End.3细胞可观察到完整的小管形成,然而,Nrf2 si RNA转染明显抑制了小管形成,与si RNA NC相比(P<0.01),提示Nrf2可促进小管形成。6、为了阐明Nrf2促血管新生的作用机制,首先通过Western blot分析研究VEGF、p-Akt、Akt、ERK、p-ERK、HO-1和ACTIN蛋白表达情况。我们发现Nrf2 si RNA显著降低VEGF、p-Akt、Akt、HO-1蛋白的表达,与si RNA NC相比(P<0.01),ERK,P-ERK蛋白表达两组间无明显差异。实验表明Nrf2在低氧诱导的b End.3细胞中,通过P13K/AKT信号通路发挥促血管新生的作用,同时影响下游基因VEGF和HO-1的表达。结论:1、Nrf2 si RNA抑制了缺氧条件下b End.3细胞的迁移能力、增殖能力及成血管的能力,这些结果表明,Nrf2具有促血管新生的作用。2、Nrf2通过PI3K/Akt-VEGF信号通路促进缺氧条件下的b End.3细胞血管新生。3、Nrf2促进缺氧条件下的b End.3细胞血管新生的作用可能与HO-1有关。