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第一部分人原发性肝细胞癌中B7-H1的表达[目的]研究人原发性肝细胞癌中浸润性白细胞的种类及B7-H1的表达水平。[方法]获取人原发性肝细胞癌标本及癌巢周围肝组织标本，一部分经消化后，通过75％-100％双层Ficoll密度梯度离心法分离肝癌细胞或肝细胞以及组织浸润白细胞，使用CD45、CD3、CD4、CD8、HLA-DR、CD14、CD11c、B7-H1、小鼠抗人IgG1同型对照及CD123进行流式细胞染色，对比分析肝癌组织和癌周组织中以下细胞的比例及B7-H1在各种细胞中的表达情况：CD45~-的肝癌细胞或肝细胞、CD3~+CD4~+或CD3~+CD8~+T细胞、CD3~-HLA-DR~+巨噬细胞(即枯否氏细胞)、CD3~-CD14~-HLA-DR~+CD4~+CD11c~+髓样树突状细胞和浆细胞样树突状细胞；取另一部分组织，固定在OCT冰冻切片包埋剂中，制成冰冻切片用于荧光免疫组织化学检查。[结果]流式细胞分析及荧光免疫组织化学检查均显示：肝癌组织浸润白细胞的数量比癌周组织高，但CD4~+及CD8~+T细胞、枯否氏细胞、髓样树突状细胞和浆细胞样树突状细胞在两者中的比例没有差别。肝癌细胞、T细胞、髓样树突状细胞和浆细胞样树突状细胞表达很低水平的B7-H1。枯否氏细胞是肝癌及癌周组织浸润白细胞中主要表达B7-H1的细胞，且肝癌组织中B7-H1~+枯否氏细胞的比例高于癌周组织。[结论]与癌周组织相比，人原发性肝细胞癌中有较多白细胞浸润，但各种白细胞的比例没有差异，说明肝癌微环境的免疫抑制状态的形成原因不是浸润白细胞的数量和亚类的比例，而是白细胞的功能改变。其中枯否氏细胞表达高水平的B7-H1，其可能通过B7-H1／PD-1介导对T细胞的抑制。第二部分肝癌微环境促进抗原提呈细胞表达B7-H1的机理[目的]研究肝癌微环境促进枯否氏细胞表达B7-H1的机理。[方法]分离正常人外周血单核细胞，磁珠分选CD14~+细胞，与人原发性肝细胞癌细胞系Hep G2在Transwell体系中共培养48小时。比较B7-H1在单独培养的CD14~+细胞与经过共培养的CD14~+细胞中的表达差异，并对比筛查培养体系中各种细胞因子浓度。使用ELISA进一步检测肝癌微环境中诱导B7-H1升高的细胞因子，通过阻断共培养体系中该细胞因子，或在CD14~+细胞单独培养时加入该种外源性细胞因子，最后检测B7-H1的表达水平，确定肝癌微环境促进B7-H1表达的机理。[结果]CD14~+细胞与Hep G2细胞共培养后，B7-H1表达明显升高。通过筛查和ELISA检测，确定共培养体系上清中TNF-α和IL-10的量较CD14~+细胞或Hep G2细胞单独培养时显著增加。阻断TNF-α或IL-10的作用，可降低CD14~+细胞与HepG2细胞共培养体系中B7-H1的表达量。加入外源性TNF-α或IL-10到单独培养的CD14~+细胞中可诱导B7-H1的表达上调。[结论]外周血CD14~+细胞是组织浸润巨噬细胞的前体，与肝癌细胞系共培养能促进CD14~+细胞B7-H1的表达，其中的TNF-α与IL-10的表达升高是主要作用机理。这提示肝癌微环境中的TNF-α与IL-10是上调抗原提呈细胞B7-H1表达上调的主要因素。第三部分人原发性肝细胞癌中PD-1的表达，对T细胞功能的影响及PD-1~+细胞与B7-H1~+细胞的定位[目的]研究人原发性肝细胞癌中浸润性T细胞PD-1的表达情况及的表达水平及其对T细胞功能的影响，并确定PD-1~+细胞与B7-H1~+细胞在空间上的关系。[方法]分离人原发性肝细胞癌标本及癌巢周围肝组织中浸润白细胞，使用CD45、CD3、CD4、CD8、PD-1、Ki-67、IFN-γ、TNF-α、Granzyme B及Perforin进行流式细胞染色，对比分析肝癌组织和癌周组织中T细胞PD-1的表达情况，并对比分析PD-1对T细胞增殖及表达IFN-γ／TNF-α及Granzyme B／Perforin的影响。通过荧光免疫组化进一步确定PD-1的表达情况，并观察PD-1~+细胞与B7-H1~+细胞在空间定位上的关系[结果]流式细胞分析及荧光免疫组织化学检查均显示：CD8~+T细胞在肝癌及癌周组织中是主要表达PD-1的细胞，且肝癌组织中PD-1~+CD8~+T细胞的比例高于癌周组织。CD8~+T细胞在肝癌及癌周组织中是主要表达PD-1的细胞，且肝癌组织中PD-1~+CD8~+T细胞的比例高于癌周组织。Ki-67是细胞增殖的标志之一。癌周组织中Ki-67~+CD8~+T细胞的比例高于肝癌组织。重点分析肝癌组织中CD8~+T细胞：PD-1~+CD8~+T细胞较PD-1~-CD8~+T细胞表达较少的Ki-67，IFN-γ／TNF-α及GranzymeB／Perforin。荧光免疫组织化学确定肝癌组织中CD8~+细胞高表达PD-1，并且进一步显示：肝癌中大多数PD-1~+细胞与B7-H1~+细胞位于癌巢周围，且两种细胞有相互聚集、相互作用的趋势。[结论]CD8~+T细胞是发挥抗肿瘤作用的主要细胞之一。肝癌中CD8~+T细胞的PD-1表达增加，而增殖能力减弱。对比分析说明PD-1的表达与CD8~+T细胞的增殖能力及功能性细胞因子或酶的表达呈负相关。PD-1在CD8~+T细胞的高表达影响其抗肿瘤能力。PD-1~+细胞与B7-H1~+细胞常定位于癌巢周围，互相之间有聚集和作用的趋势。这说明肝癌中CD8~+T细胞在质(PD-1高表达)和位(与B7-H1~+有接触趋势)上均有与B7-H1~+枯否氏细胞相互作用的优势。第四部分阻断B7-H1／PD-1通路增强CD8~+T细胞的抗肿瘤能力[目的]研究阻断B7-H1／PD-1通路在恢复CD8~+T细胞抗肿瘤能力中的作用。[方法]分离肝癌组织浸润白细胞，磁珠分选CD14~+细胞及CD8~+细胞。体外共培养CD14~+细胞和CD8~+细胞，利用抗人CD3和CD28抗体刺激CD8~+T细胞，根据不同分组加入抗PD-1或抗B7-H1阻断性抗体，以及同型对照小鼠IgG1。共培养五天后，使用CD5、CD8、PD-1、Ki-67、IFN-γ、TNF-α、Granzyme B及Perforin进行流式细胞染色，检测阻断B7-H1／PD-1通路后，T细胞增殖及抗肿瘤功能是否恢复。同时利用氚掺入增殖实验及酶联免疫斑点实验(ELISPOT)分别检测T细胞的增殖能力及肿瘤抗原特异性IFN-γ分泌能力，进一步确定阻断B7-H1／PD-1通路的效应。[结果]肝癌浸润CD8~+T细胞高表达PD-1，CD14~+枯否氏细胞高表达B7-H1。分选出肝癌组织中的CD14~+细胞及CD8~+细胞，共培养五天后，CD8~+T细胞的增殖和抗肿瘤细胞因子或酶的表达明显授抑制。通过加入抗PD-1或抗B7-H1阻断性抗体可明显促进CD8~+T细胞的增殖，即Ki-67表达水平及氚掺入实验中的CPM值。另一方面，阻断性治疗可以恢复CD8~+细胞分泌抗肿瘤细胞因子和酶的能力。同型对照抗体没有类似效应。通过ELISPOT进一步发现，抗PD-1或抗B7-H1阻断性治疗能增加CD8~+细胞针对肿瘤抗原特异性的IFN-γ产量。[结论]抗PD-1或抗B7-H1阻断性抗体可以打破B7-H1／PD-1通路的共抑制效应，恢复CD8~+细胞的增殖能力，增强其分泌抗肿瘤细胞因子和酶的能力。这说明阻断B7-H1／PD-1通路能逆转肝癌浸润CD8~+T细胞的无能状态，增强其抗肿瘤能力。提示针对B7-H1／PD-1的免疫学治疗将可能是配合手术治疗肝癌并预防复发的途径之一。