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文昌鱼(Amphioxus)是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型，是研究动物进化和胚胎发育的典型材料。利用分子生物学手段，研究文昌鱼有关基因的结构、进化和表达，可以揭示文昌鱼发育的分子生物学机制，有助于我们从分子水平上来了解脊椎动物的起源和进化。本文从青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtaunese)肠cDNA文库(本实验室保存)中，克隆了具有完整编码框的信号识别颗粒SRP19(AmphiSRP19)、溶菌酶(AmphiLysC)和核糖体蛋白S19(AmphiS19)，并对其结构、表达和进化展开了研究。 AmphiSRP19全长869bp，编码141个氨基酸组成的蛋白。该蛋白与人、小鼠、果蝇、大米、水芹和五种真菌的SRP19蛋白的相似性分别为52.8％，54.9％，42.3％，35.3％，28.2％和19.7％-24.6％。与其他真核生物SRP19蛋白一样，位于SRP RNA结合位点上的氨基酸残基在AmphiSRP19同样是高度保守的。Northem blot和原位杂交表明，AmphiSRP19在文昌鱼成体不同组织(包括脊索、鳃、肌肉、肠、精巢和卵巢)和胚胎发育的不同阶段(从2个细胞到2天幼虫)，都检测到了表达，表明SRP19为管家基因(house-keeping gene)。 C型溶菌酶基因广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中，但是在原索动物门尾索类中，却没有发现C型溶菌酶基因的存在。我们从头索动物文昌鱼中首次克隆到了C型溶菌酶基因cDNA序列，命名为AmphiLysC。该基因全长651bp，编码一个140个氨基酸组成的蛋白质。在编码框两侧设计引物，扩增青岛文昌鱼基因组DNA，得到两个片段，分别命名为AmphiLys1和AmphiLys2。AmphiLys1全长2 350bp，其基因结构与脊椎动物C型溶菌酶基因相同，即有4个外显子和3个内含子组成。AmphiLys2全长1 451bp，有5个外显子和4个内含子组成，在第2和第3个内含子两端缺少RNA正确剪切所必需的识别位点(GT／AG)。所以，我们不能排除AmphiLys2是假基因的可能。Southern blot杂交结果显示，文昌鱼基因组中存在2个拷贝C型溶菌酶基因，这与基因组DNA扩增结果一致。可见，在青岛文昌鱼基因组DNA中存在有两个C型溶菌酶的基因拷贝。 中国海洋大学博士学位论文 文昌鱼C型溶菌酶具有消化型溶菌酶的主要特点如等电点偏低(5.%)，最适pH为酸性(5.5)。此外，RT-pCR和Northem blot结果表明，A呷hil沙se在成体消化道中表达最丰富。这说明文昌鱼C型溶菌酶可能执行消化功能。但是，在文昌鱼成体其他组织如卵巢、精巢、脊索、鳃和肌肉中也检测到了Amphil沙SC的表达，同时原位杂交结果也表明，Amphi人”C在文昌鱼胚胎发育的不同阶段 (从2个细胞到2天幼虫)都有广泛的表达。所以，我们推测文昌鱼C型溶菌酶可能执行消化和免疫双重功能。 对不同类型的溶菌酶(包括C型、I型和G型)进行系统进化分析，发现来自不同物种的C型、G型和I型溶菌酶各自聚集成簇，AmPh 1 Lysc与无脊椎动物C型溶菌酶聚在一起。在进化树中，C型溶菌酶和I型溶菌酶更接近一些，而G型溶菌酶位于C型和I型溶菌酶的基部。这些结果支持G型溶菌酶在结构上最接近溶菌酶祖先的假说。 本文最后一部分对文昌鱼核糖体蛋白519基因进行了序列比较和系统进化分析。月即力jsjg全长609bp，编码一个147个氨基酸组成的蛋白，分子量为16，222Da，pl为10.44。枷phiS19与其他13种真核生物S一9进行序列比对，发现AmPh 1 519与脊椎动物519的相似性大于71 .0%，而与无脊椎动物519的相似性小于59.9%，说明Am曲1519与脊椎动物519的亲缘关系更近一些。通过对脊椎动物和无脊椎动物519蛋白的系统进化分析，发现Amphislg位于脊椎动物和无脊椎动物同源物之间，而且AmPh 1 519首先从脊索动物519基部分支出来。另外，AmphiS19与脊椎动物各519蛋白在氨基酸水平上的相似性几乎是等同的。这些结果表明文昌鱼不仅是脊椎动物的姊妹类群，而且是脊索动物谱系进化过程中的基部类群。