论文部分内容阅读
白血病是造血干细胞克隆性疾病,是一组高度异质性的恶性血液病。医学专家建议,针对急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)应早发现、早诊断、早治疗。目前世界卫生组织(world health organization,WHO)采用最新的MIC分型法,根据细胞形态学(morphology)、免疫学(immunology)和细胞遗传学(cytogenetic)对AML进行分类,但是仍有约一半的原发病例因为其核形正常而被归于分类不明的一类,直接影响此类患者的诊断及预后,因此,迫切需要寻找更多应用于白血病的辅助检测指标。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin, NPM)是一种广泛表达的、主要位于核仁颗粒区的多功能蛋白,作为组蛋白、p53、ARF(ADP ribosylation factor)、Bax等多种蛋白质的分子伴侣,参与调控细胞的增殖和凋亡。NPM在实体肿瘤中通常表现为高表达,而在血液系统的恶性疾病中,NPM更多的时候是发生基因突变。NPM突变基因表达的蛋白质不仅在细胞中定位发生改变,由核仁移位至胞浆中,而且其正常生理功能亦受到影响,研究发现NPM突变与白血病的发生发展密切相关,白血病中存在多种NPM突变类型,其中NPM A型突变体(Nucleophosmin mutation A, NPM-mA)最常见。因此近年来国外有学者建议WHO将突变NPM纳入白血病分型的辅助检测指标中。目前突变NPM的检测方法包括免疫组织化学染色、分子生物学方法和变性高效液相分析等。而国内临床常用的免疫组织化学染色所需的单克隆抗体仍依赖于国外进口,导致该方法的应用受限。1975年Kohler和Milstein发明的杂交瘤技术使单克隆抗体的制备成为现实,他们利用小鼠骨髓瘤细胞与绵羊细胞致敏的小鼠脾脏细胞融合,得到的一部分融合细胞既能在体外培养,又能分泌抗羊红细胞抗体,这种杂交细胞系统被称为杂交瘤,应用这种方法可制备识别单一抗原决定簇的抗体。本课题主要采用分子克隆技术和杂交瘤细胞技术,分别构建NPM和NPM-mA与硫氧还蛋白(thioredoxin,TrxA)的融合表达载体,诱导表达及纯化两种融合蛋白质,并进一步利用这两种蛋白免疫小鼠制备相应的单克隆抗体。主要结果和结论如下:1.利用软件分析证实NPM与NPM-mA两种蛋白质共同和差异氨基酸序列中均有可能存在抗原表位,利用高保真酶分别扩增两种蛋白质的开放阅读框序列后成功克隆入原核表达载体pET-32a(+),IPTG诱导含重组载体的两种表达菌,分泌型表达两种融合蛋白,采用HisBinding柱初步纯化得到两种融合蛋白。2.将两种融合蛋白作为抗原免疫小鼠,按照经典的杂交瘤细胞技术进行单抗制备,间接ELISA成功筛选出一株针对NPM的IGg型单克隆抗体,此抗体与NPM-mA存在交叉反应;目前仍未筛出特异性针对NPM-mA的单抗。