前言雌激素(Estrogen, E)是一种类固醇激素,其主要成分为雌二醇(Estradiol, E2)。雌二醇有a和β两种类型,其中β型生物作用强。大量研究表明,雌激素除了对生殖系统具有调控作用以外,在治疗更年期综合征、抗骨质疏松、预防心血管疾病及对中枢神经系统的保护作用等方面都有很高的研究及应用价值。心血管系统疾病是绝经后妇女病死的主要原因之一,大于50岁的妇女约53%死于心血管疾病。绝经后妇女应用雌激素替代疗法(Estrogen Replacement Therapy, ERT)可使心血管疾病的发病率下降35%—50%,提示雌激素对心血管系统具有保护作用,然而其保护作用的机制目前还不十分清楚。近年来发现雌激素可直接作用于心肌及血管平滑肌,产生负性变力作用,扩张血管,并且有证据表明雌激素对钙通道电流有抑制作用。ERT有导致乳房、卵巢和子宫内膜肿瘤发生的危险,因此深入研究雌激素对心血管作用的保护机制,寻找一种理想的ERT药物,尽可能地减少其副作用,将对心血管系统疾病的防治起到重要作用。因此我们应用膜片钳技术研究17p-雌二醇(17β-E2)对豚鼠心室肌细胞L型钙通道电流(ICa-L)的影响,从电生理学的角度探讨17β-雌二醇的心血管系统保护作用及其作用机制,为开发安全有效的雌激素替代药物和指导临床用药提供实验依据。材料与方法1、实验动物及分组实验选用健康成年豚鼠(300-400)g,雌性。实验分为五组,对照组：记录正常细胞外液灌流时豚鼠心室肌细胞ICa-L；应用17β-E2三组：分别记录含17β-E2(10-9、10-8、10-7mol／L)的细胞外液灌流时豚鼠心室肌细胞ICa-L；17β-E2+受体阻断剂组：用雌激素特异性受体阻断剂三苯氧胺(Tamoxifen, TAM) (10"7mol/L)预处理1h后,记录含17β-E2(10-7mol／L)和TAM(10-7mol／L)的细胞外液灌流时豚鼠心室肌细胞ICa-L。2、实验仪器膜片钳放大器,数模转换器,微操作器,倒置显微镜,微电极拉制仪,微电极抛光仪,防震台,Langendorff灌流装置,小型动物呼吸机,数控超级恒温槽,低速离心机,超声波清洗器,恒温水浴锅,pH计,电子天平,磁力搅拌器,手术器械。3、溶液与药品无钙台氏液(mmol／L)、含钙台氏液(mmol／L)、KB液(mmol／L)、电极内液、胶原酶(Collagenase)、蛋白酶(Protease)、17β-雌二醇、三苯氧胺。4、豚鼠心室肌细胞的分离1%戊巴比妥钠按100mg／kg腹腔注射麻醉豚鼠,气管插管,开胸分离主动脉并插管,分离心脏并连接于Langendorff灌流装置上,用普通台氏液灌流3min后换无钙台氏液灌流6min,再用含有0.05%胶原酶的无钙台氏液灌流10-15min,待心室肌组织消化后,用KB液灌流终止酶的消化,取左心室机械游离单个心室肌细胞,滤网过滤,离心后置于KB液中,4℃冰箱保存备用。5、ICa-L的记录方法将分离好的细胞悬液滴于倒置显微镜上方的浴槽内,选择静止、杆状、横纹清晰、折光性良好的单个心室肌细胞,采用全细胞记录模式记录ICa-L。6、电容值的测量方法打开一个已记录的ICa-L数据样本,选择钳制电压下方的电压线,确定第n个Sweep,然后在View对话框中的Select Sweep对话框中选择相应的第n个Sweep,按OK按钮。调整1,2,3,4光标,然后在数据统计图标的对话框中选择相应的条目,按OK按钮,在Result对话框中生成相应的曲线下面积值,将曲线下面积值除以10得到电容值。7、数据处理与统计学分析所有数据在pCLAMP 10.0中进行分析及测量。实验结果用Mean±SD表示,将给药组和对照组进行两组资料t检验分析,P<0.05为差异有显著性,P<0.01为差异有高度显著性。实验结果1、17β-E2对不同膜电位下豚鼠心室肌细胞ICa-L的影响17β-E2(10-9、10-8、10-7mol／L)使ICa-L峰电流密度值从(-3.5±1.4)pA／pF分别减少至(-2.5±0.2)pA／pF、(-2.1±0.7)pA／pF和(-1.3±0.5)pA／pF(与对照组比较,均为P<0.01,n=5)。ICa-L峰电流密度值减少百分数分别为26.8%、40%和62.9%。电流电压曲线显示17β-E2浓度越高抑制的程度越明显,但Ⅰ-Ⅴ曲线的形状和峰值电压无明显变化。2、TAM预处理后17β-E2对不同膜电位下ICa-L的影响TAM(10-7mol／L)预处理后,17β-E2(10-7mol／L)使ICa-L峰电流密度值从(-3.5±1.4)pA／pF减少至(-1.2±0.5)pA／pF(与对照组比较,P<0.01,n=5),ICa-L峰电流密度减少百分数为65.7%,与未应用TAM(10-7mol／L)预处理的17β-E2(10-7mol／L)作用下ICa-L峰电流密度值(-1.3±0.5)pA／pF相比较,ICa-L峰电流密度值无显著变化(P>0.05,n=5)。讨论钙通道是心肌细胞膜上最重要的膜蛋白之一。根据钙通道的分子生物学及其钙电流的动力学特征,可将其分为长时间激活型(L型)及瞬时激活型(T型),其中L型钙通道的开放及钙离子内流而产生的慢钙内向电流,在心肌细胞动作电位复极和兴奋-收缩偶联过程中起重要作用,是决定心肌细胞动作电位平台期长短的重要因素。本研究应用膜片钳全细胞记录方法,观察了17β-E2对豚鼠心室肌细胞ICa-L的影响。本实验发现17β-E2可抑制ICa-L,且抑制作用呈浓度依赖性,推测17β-E2可能通过抑制ICa-L缩短动作电位平台期。抑制内向钙电流或促进外向钾电流均使动作电位平台期缩短,17β-E2是否促进钾外流目前还不清楚。17β-E2抑制ICa-L,使动作电位时程缩短,导致Ca2+内流减少,心肌收缩力减弱,降低心脏作功和心肌氧耗。此外,进入细胞内Ca2+降低,有利于线粒体将堆积的Ca2+排出,减轻Ca2+超载,发挥对心脏的保护作用。本实验发现17β-E2用雌激素特异性受体阻断剂TAM预处理后,对ICa-L的抑制作用与未应用TAM预处理相比没有明显变化,提示17β-E2抑制ICa-L的作用不是由雌激素核受体介导的,推测该作用可能是通过直接与钙离子通道上或与钙通道调节蛋白的某位点结合而发挥作用。本实验发现生理浓度的17β-E2能够抑制ICa-L,这种抑制作用不被雌激素特异性受体阻断剂TAM阻断,提示17β-E2对ICa-L的作用可能未通过基因转录过程,而是直接作用于钙通道或通过其他途径发挥生物学效应。结论1、17β-E2抑制豚鼠心室肌细胞ICa-L,作用呈浓度依赖性。2、雌激素特异性受体阻断剂TAM不能阻断17β-E2对豚鼠心室肌细胞ICa-L的抑制作用,提示17β-E2对ICa-L的抑制作用可能与ER作用无关。3、低剂量即生理浓度17β-E2即可抑制豚鼠心室肌细胞ICa-L,发挥生物学效应。