论文部分内容阅读
萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus Pallas)隶属于轮虫动物门(Rotifera),单巢纲(Monogononta),游泳目(Ploima),臂尾轮虫科(Brachionidae),是最常见的淡水浮游动物。由于其个体小(约100-500μm)、生命周期短(5-7d)、并且在实验室易于培养、衰老特征明显等特性,被认为是极具潜在价值的衰老生物学研究的模式生物之一。mTOR是一种高分子量的蛋白激酶,其响应细胞内的许多调节过程,包括有丝分裂及养分供应,其中S6K和S6基因为TOR信号通路的下游底物。而热休克蛋白(HSPs)是一种小分子量蛋白,在机体受到胁迫时被诱导并出现应激效应。mTOR的磷酸化可促进HSP70伴侣复合物的释放,同时伴随着合成热休克蛋白的能力大幅度下降。但二者间的调节机制及其相互作用在轮虫衰老过程中的作用尚鲜有报道。本文通过研究不同温度对萼花臂尾轮虫(B.calyciflorus)寿命,生殖量和生殖前期及生殖后期的影响;克隆TOR、S6K、S6和HSP70基因片段,并在不同温度不同时间处理后研究温度对其基因表达量的影响,以及研究高温和低温不同时间处理下的MnSOD,CAT和CuSOD基因表达变化量差异,为轮虫衰老生物学提供科学依据。1.温度对萼花臂尾轮虫寿命和生殖量的影响光照强度为4000lx,昼长比为(L:D)16:8,温度设置为15℃,20℃,25℃,30℃和35℃5个梯度组。结果发现,25℃培养轮虫时,轮虫的平均寿命为165.84±5.28h,15℃处理下轮虫的平均寿命为275.76±6.52 h,与25℃处理组相比,寿命延长效果显著(66.28%,P<0.01),生殖前期和生殖后期分别延长92.09%和65.09%(P<0.001);20℃处理下轮虫的平均寿命为198.72±5.21h,较25℃处理组延长19.82%,生殖前期和生殖后期分别延长7.62%和17.92%;30℃和35℃处理下轮虫的平均寿命为75.36±2.32h和67.2±1.78h,与25℃处理组相比,寿命分别缩短54.55%和59.48%(P<0.05);30℃轮虫的生殖前期和生殖后期分别缩短62.63%和12.17%;35℃时缩短77.43%和53.77%(P<0.05)。轮虫生殖量的研究结果发现,与25℃组处理组相比,15℃,20℃,30℃和35℃各温度处理下,轮虫的总生殖量并无显著差异(P>0.05)。2.温度对萼花臂尾轮虫TOR,S6K和S6与HSP70基因表达的影响自转录组获得TOR的基因片段为375bp,其编码125个氨基酸;S6基因片段为735bp,其编码245个氨基酸;S6K基因片段为951bp,其编码317个氨基酸;HSP70的基因片段2152bp,其编码656个氨基酸。利用实时荧光定量PCR技术检测TOR,S6K和S6三者与HSP70的基因表达变化量。结果显示前三者的基因表达量变化趋势基本一致,且与HSP70的基因表达变化在15℃,20℃,30℃,和35℃下都表现出明显的相互抑制趋势。具体表现为:前三者在15℃时,2h处理下,S6K基因表达量最高,约为对照组的0.65倍,此时HSP70的基因表达量约为对照组的6.5倍,差异性极显著(P<0.001);20℃时,3h处理下,前三者中S6基因表达变化量最高,约为对照组的0.9倍,此时HSP70的基因表达量约为对照组的5.3倍,差异性极显著(P<0.001);25℃时,各时间处理间,前三者与HSP70的基因表达量均无显著差异(P>0.05);30℃时,经6h处理,前三者中TOR基因表达量最高,约为对照组的0.46倍,此时HSP70的基因表达量约为对照组的4.4倍,差异性极显著(P<0.001);35℃时,3h处理下,前三者中S6K的基因表达量最高,约为对照组的1.4倍,此时HSP70的表达量约为对照组的12倍,差异性也极显著(P<0.001)。3.温度对萼花臂尾轮虫CuSOD,CAT和MnSOD基因表达的影响本实验研究了萼花臂尾轮虫在低温15℃和高温35℃处理下CAT,MnSOD和CuSOD各基因的表达变化量变化。在15℃下,处理1h时,CAT的mRNA基因表达变化量最高,约为对照组的2.2倍(P<0.001),之后呈下降的趋势,在4h时基因恢复正常水平。15℃处理5h时,CuSOD和MnSOD的基因表达变化量最高,分别为对照的2.7倍和3.4倍(P<0.001)),CuSOD的基因表达量在前5h呈上升的趋势,6h时略有下降,但仍然高于对照,MnSOD的基因表达变化量在前5h也呈上升趋势,6h时恢复正常水平。在35℃下,处理1h和2h时,CAT的基因表达变化量最高,约为对照组的5.9和4.3倍(P<0.001),在5h时恢复正常水平,总体趋势呈逐渐下降。35℃下,2h时,CuSOD的基因表达量最高为对照组的4.4倍(P<0.001),而MnSOD的基因表达量在1h时表达量最高约为对照组的3.2倍,之后两者都下降,CuSOD在6h时基因表达变化量低于正常水平,约为对照组的0.63倍(P<0.05),而MnSOD的基因表达变化量在6h时也显著低于正常水平的0.4倍(P<0.001)。