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本文以金龟子绿僵菌蝗变种(Metarhizium anisopliae var. acridum) CQMa102菌株的总RNA为模板,以RT、1P5和1P3、2P5和2P3为引物,在体外通过RT-PCR的方式成功克隆出了该菌酪氨酸蛋白磷酸酶的表达基因序列。将该基因片段克隆到表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母KM71,并用0.5%的甲醇对其进行诱导培养。对诱导培养144h后的粗酶液进行SDS-PAGE和酶特性分析,结果表明重组PD在毕赤酵母中表达出了酪氨酸蛋白磷酸酶。有研究已经表明,该酶在体外能改变其寄主(蝗虫)血淋巴中与信号传导相关的蛋白(Toll-like receptor)的磷酸化状态,进而可能干涉寄主体内免疫活动。因此,本研究将为从蛋白水平分析绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶对蝗虫体液免疫防御的影响和探讨病原真菌干扰寄主体液免疫的可能机制提供物质基础。全文的主要结论如下：一、绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆根据绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的已知序列设计引物,从绿僵菌的总RNA中扩增出一条1900bp左右的基因片段。将该基因片段和pMD19-T质粒连接,转化感受态大肠杆菌,结合PCR方法筛选阳性克隆。其基因片段的序列分析结果表明该基因片段共1960bp,含有引物中的2个EcoRl酶切位点和6个组氨酸标记；而且该基因片段中含有绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的表达基因,可编码一个含647个氨基酸的蛋白质,该蛋白质氨基酸序列中还包含酪氨酸蛋白磷酸酶质谱测序获得的有5段肽段氨基酸序列即：DITNFFGVKEPEVEK, WYEDLFAEDK, GNDSALDLPGLK, NIQYGTGVNFPSNWEPR, ALGDLLEELDDTVR;证明克隆正确。二、毕赤酵母的表达重组载体的构建根据毕赤酵母表达系统的特点和要求,选用pPIC9K质粒载体连接目的基因,转化感受态大肠杆菌,结合PCR方法筛选阳性克隆。阳性克隆的测序分析结果表明目的基因已经插入pPIC9K质粒的开放阅读框内,且目的基因的5’端连接在pPIC9K质粒的信号端,证明目的基因的毕赤酵母表达重组载体已经构建成功。三、目的基因的整合及其高效表达菌株的筛选用电转化法将构建的毕赤酵母重组载体转化感受态毕赤酵母KM71,并结合遗传霉素抗性和PCR方法筛选阳性克隆。挑取不同遗传霉素抗性的阳性克隆进行甲醇诱导表达,对不同时间段的培养液进行透析、pNPP底物的相对酶活性测定。其培养液相对酶活性测定的分析结果表明,抗遗传霉素浓度为3.0mg/ml的14号菌株的培养液相对酶活性明显高于其他菌株,且该菌株培养144h时的培养液相对酶活性最高,证明14号菌株有可能高效表达目的蛋白。四、粗酶液的SDS-PAGE及其酶特性分析粗酶液经过SDS-PAGE分析得到一条75.6KDa的蛋白质片段,与目的基因表达的酪氨酸蛋白磷酸酶的分子量大致相同。酶底物特异性分析表明粗酶液中的磷酸酶对磷酸酪氨酸残基的专一性较强,Cu2+可明显抑制该粗酶液对8mM PNPP的水解作用,Ca2+可促进该粗酶液对8mM pNPP的水解作用,而Mg2+、Ni2+、Mn2+对该粗酶液水解8mM PNPP的活性影响不明显；而且丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶专性抑制剂NaF、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶抑制剂EDTA对磷酸酶酶解pNPP活性没有明显的抑制作用,酸性磷酸酶的特异性抑制剂酒石酸钠也对该粗酶液酶解pNPP活性影响不明显；但酪氨酸蛋白磷酸酶抑制剂钼酸钠和钨酸钠显著抑制酶对pNPP的酶解活性,证明目的基因表达的蛋白质是酪氨酸蛋白磷酸酶。该粗酶液对8mM pNPP底物的最适作用温度为60℃,而对8mM O-phospho-L-tryosine底物的最适作用温度为55℃。