论文部分内容阅读
背景及目的: 背景:二甲双胍(metformin)是一种在世界上广泛应用的,针对二型糖尿病的口服降糖药。流行病学的研究证明,长期服用二甲双胍的糖尿病患者得癌症的几率很小,这可能是由于二甲双胍具有抗肿瘤的作用。最近的许多体内和体外的研究也有证明二甲双胍有抗肿瘤的作用,但是具体的机制还不是很清楚。本实验主要是证明了二甲双胍对A549细胞的生长抑制作用,并且对二甲双胍抑制A549细胞生长的具体机制进行了深入的研究。 目的: 1.研究二甲双胍对A549细胞的生长抑制作用 2.研究二甲双胍抑制A549细胞生长的分子机制 材料和方法: 用含10%超级新生牛血清的DMEM培养基体外培养人肺腺癌A549细胞,待细胞生长融合至80%,用相对应的抑制剂或激活剂(Compound C,3-MA, chloroquine, Rapamycin等)预处理细胞1h,然后再用含不同浓度的二甲双胍(0mM,5mM,10mM,20mM)的培养基处理细胞48 h后,倒置相差显微镜观察A549细胞的形态学变化;MTT法检测细胞的存活率;DAPI染细胞核分析细胞核裂;MDC染色观察酸性自噬泡结构;TEM观察细胞超微结构变化;免疫荧光,Western Blot检测相关蛋白的表达量以及在细胞中的亚定位;caspase-3试剂盒检测caspase-3酶活性的变化;Annexin V-FITC和PI双染细胞,然后用流式细胞术检测凋亡细胞所占比例;罗丹明123染细胞后用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化情况。 结果: 1.MTT法检测显示不同剂量的二甲双胍对肺腺癌A549细胞有不同程度的杀伤作用,这种生长抑制作用呈剂量和时间依赖性关系。倒置相差显微镜可见二甲双胍诱导后的细胞里有明显的泡状物,且贴壁的A549细胞变得很容易脱离培养皿的底部。通过DAPI染细胞核未见明显的细胞核裂,但Caspase-3的酶活实验证明了Caspse-3确实被激活。且通过Annexin V-FITC和PI双染细胞,然后用流式细胞术检测凋亡细胞可见明显的早期凋亡现象,罗丹明123染细胞后用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位发生明显的下降现象。但透射电镜未显示A549细胞中有凋亡小体出现,细胞核的染色体也未见明显趋边、固缩。 2. MDC染色,LC3的免疫荧光,透射电镜及Western Blot技术检测等实验显示当0-20 mM二甲双胍作用A549细胞48 h后,A549细胞出现有明显自噬现象。 3. Western Blotting检测自噬相关通路的蛋白表达,随着二甲双胍作用浓度增加和作用时间的延长,AMPK-mTOR通路被激活,激活p-AMPK,下游的p-mTOR, p-p70s6K表达量降低,这种升高或降低能明显的被AMPK的抑制剂Compound C所逆转,同时透射电镜显示自噬体的产生也随着抑制剂的加入而减少,western blot检测也显示LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化明显减少, Caspase-3的酶活性也随着Compound C的加入而减弱。 4.当用合适浓度的自噬抑制剂3-MA和氯喹来成功抑制二甲双胍诱导的自噬的时候,用MTT法检测到的A549的细胞活力也相应的升高,同时用Caspase-3的检测试剂盒检测到的Caspase-3的酶活性也相应的降低,用 western blot法检测到凋亡相关蛋白PARP1的剪切也受到相应的抑制。 5.当用合适浓度的Caspase-3的特异抑制剂来抑制凋亡的时候, western blot检测LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化也明显增加。 结论: 1.二甲双胍在一定浓度、时间范围内抑制体外培养的人肺腺癌A549细胞的生长和增殖,其机制与二甲双胍诱导A549细胞发生自噬,促进细胞发生自噬性死亡有关。同时二甲双胍也会诱导A549细胞发生一定程度的凋亡。 2.二甲双胍能够诱导A549细胞发生自噬,与二甲双胍激活A549细胞中的AMPK有关。且二甲双胍诱导A549细胞发生的凋亡也和AMPK的激活有关。 3.抑制二甲双胍诱导的A549的自噬将会对减弱二甲双胍诱导的A549的凋亡。 4.抑制二甲双胍诱导的A549的凋亡可能引起A549细胞发生更大程度的自噬。