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目的:通过体外细胞活性实验,对重组肿瘤抑素T42肽和T19肽进行促肝癌Hcpg2细胞凋亡的比较研究,并进行了重组肿瘤抑素T19肽和T42肽与环磷酰胺联合用药的初步研究,为研发新型抗肿瘤药物和临床治疗肿瘤寻找最佳方案提供实验基础。
研究内容与方法:采用基因工程的方法使重组肿瘤抑素T42肽和T19肽在大肠杆菌中诱导表达,几丁质柱亲和层析,经Tricine SDS-PAGE鉴定T42肽和T19肽。MTT比色法测定重组肿瘤抑素T19肽、T42肽、T19肽和环磷酰胺联合、T42肽和环磷酰胺联合、环磷酰胺对正常肝细胞LO2和肝癌Hepg2细胞的增殖抑制,吖啶橙/溴化乙锭荧光染色法检测细胞凋亡的形态学变化,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测凋亡,Western blot检测细胞色素c(Cyt c)从线粒体到胞浆的易位情况、caspase-8的活性变化以及p53的表达。
结果:通过基因工程方法提取的重组肿瘤抑素T19肽和重组肿瘤抑素T42肽其相对分子质量与理论大小一致。MTT结果显示T42肽对肝癌细胞Hepg2与LD2细胞均有一定的抑制作用并呈剂量依赖的的方式,IC50分别为32.5μmol/L、47.8μmol/L。AO/EB荧光染色结果表明,经过20μmol/L的各实验组药物作用24小时后,19肽和42肽实验组对LO2肝正常细胞影响较小,对Hepg2肝癌细胞表现明显的抑制和促凋亡作用,重组T42肽+环磷酰胺和重组T19肽+环磷酰胺对肿瘤细胞的促凋亡作用明显大于环磷酰胺单独用药和42肽、19肽单独用药。重组T42肽+环磷酰胺联合用药对正常肝细胞有一定保护作用。流式细胞仪检测显示,19肽、42肽、环磷酰胺、19肽+环磷酰胺、42肽+环磷酰胺联合用药组的Hepg2细胞均出现细胞凋亡,细胞凋亡率分别为17.4%、18.9%、20.3%、33.5%、60.9%。表现出联合用药组较单独用药组促凋亡作用强,联合用药组对2种细胞均有作用,且Hepg2组作用明显。Western blot结果显示T42肽引起细胞色素c(Cyt c)从线粒体释放到胞浆,而对caspase-8的活性没有影响;p53的表达随时间表达逐渐增强。
结论:
1、本研究进一步证明了我们把T19肽和T21肽通过RGD和柔性连接构建表达的T42肽完全保留了重组肿瘤抑素T19肽的促肿瘤细胞凋亡作用。
2、同等剂量的19肽和42肽对正常细胞的影响则很小。重组T42肽+环磷酰胺和重组T19肽+环磷酰胺对肿瘤细胞的促凋亡作用明显大于环磷酰胺单独用药和.42肽、19肽单独用药。重组T42肽+环磷酰胺联合用药对正常肝细胞有一定保护作用。
3、肿瘤抑素T42肽凋亡的机制主要是线粒体途径,与Cyt c释放有关。
4、肿瘤抑素T42肽作用肿瘤细胞p53的表达随时间逐渐增强,说明其通过稳定p53蛋白而发挥诱导细胞凋亡作用的。