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巨噬细胞是一种多功能免疫细胞,在机体的特异性和非特异性免疫反应中均发挥重要作用。除了吞噬异物、提呈抗原以及炎症反应等全身效应,巨噬细胞在局部组织的浸润情况与多种疾病的发生发展密切相关。尤其是肿瘤组织局部浸润的巨噬细胞,可通过调控肿瘤的侵袭和转移影响患者预后,但相关机制尚未明确。研究调控巨噬细胞的增殖、分化以及功能极化的分子机制,将有助于阐明其与肿瘤发生发展的相关性,并为靶向肿瘤巨噬细胞相关的肿瘤免疫治疗提供新靶点。RIOK3(RIO Kinase 3)是一种非典型丝苏氨酸蛋白激酶,与RIOK1、RIOK2一起同属于RIO(right open reading frame)家族的一员。有研究表明,RIOK3与Ⅰ型干扰素的产生、NF-κB信号转导通路、Hedgehog信号转导通路以及Akt/mTOR通路的活化有关,并参与调控细胞免疫功能和细胞增殖。mRNA表达谱分析结果表明RIOK3在髓系细胞中呈现高表达,提示该蛋白可能参与了巨噬细胞的相关功能。利用我们已经建立的巨噬细胞RIOK3特异性敲除小鼠(LysM Cre RIOK3 LoxP/LoxP,以下简写为RIOK3-/-)、恶性黑色素瘤原位及肺组织转移模型,运用基于RNA-seq的转录组研究等研究手段,本研究从分子、细胞以及模式动物水平全面解析了 RIOK3对巨噬细胞功能及肿瘤侵袭转移的调控作用:1)RIOK3对巨噬细胞增殖、分化以及极化的影响;2)RIOK3对巨噬细胞活化的关键通路M-CSF/PI3K/Akt的调控效应;3)RIOK3通过影响巨噬细胞在肿瘤组织局部的增殖、分化以及极化调控肿瘤的侵袭和转移。主要研究成果如下:1)RIOK3具有抑制巨噬细胞的增殖、促进其凋亡效应;可抑制巨噬细胞M2型极化;但不影响巨噬细胞的分化成熟;2)RIOK3可抑制M-CSF/PI3K/Akt通路活化,并由此抑制巨噬细胞的增殖;3)RIOK3可抑制恶性黑色素瘤组织内肿瘤相关巨噬细胞的浸润数量,并可抑制肿瘤的侵袭和转移。本研究首次发现RIOK3通过调控M-CSF/PI3K/Akt通路活化抑制巨噬细胞的增殖、M2型极化,进而减少肿瘤组织内巨噬细胞浸润,降低恶性黑色素瘤的侵袭及转移。研究成果为以RIOK3作为肿瘤相关巨噬细胞的免疫治疗新靶点提供了科学依据。第一部分 RIOK3对巨噬细胞增殖、分化和极化功能的影响目的:探索丝/苏氨酸激酶RIOK3对巨噬细胞功能的影响。方法:分离4-6周雌性小鼠(C57野生型以及RIOK3-/-)骨髓有核细胞,经M-CSF诱导7天分化为原代巨噬细胞,分别以巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF,M0)、干扰素-γ/脂多糖联合(IFN-γ+LPS,M1型极化)、白介素-4(IL-4,M2型极化)刺激活化。收集细胞,提取RNA进行全转录组RNA测序(RNA-seq),对显著差异表达的基因(DEGs)进行功能富集分析以及RT-qPCR验证,概览RIOK3对巨噬细胞增殖、分化和极化的影响。以M-CSF诱导巨噬细胞,CCK8检测细胞增殖,CFSE染色结合流式细胞仪检测跟踪细胞传代分裂的动态过程,细胞周期实验计算处于有丝分裂活跃期的细胞比例,细胞凋亡实验检测M-CSF饥饿处理后细胞凋亡的情况,流式抗体染色巨噬细胞的成熟分化指标评估细胞分化。结果:RNA-seq结果显示RIOK3敲除巨噬细胞与野生型巨噬细胞的转录组存在差异表达基因(DEGs)。M-CSF(M0)刺激时DEGs所富集的功能主要是细胞周期,并包括细胞分裂、细胞凋亡、细胞增殖等。以野生型细胞为对照,收集M-CSF刺激下RIOK3敲除细胞进行分析,RT-qPCR结果证实细胞周期相关基因Ccnd1表达显著增多,CCK8实验结果表明细胞增殖信号增强,结晶紫染色后细胞计数证实其细胞数目明显增多。流式细胞实验动态检测细胞分裂情况,结果表明RIOK3敲除细胞平均分裂次数以及分裂细胞在原代细胞中所占有的比例均高于对照组。细胞周期实验结果表明RIOK3敲除细胞其处于细胞分裂活跃期(S期和G2期)的细胞比例高于对照组。细胞凋亡实验结果表明M-CSF饥饿处理后,野生型细胞发生明显的凋亡,而RIOK3敲除巨噬细胞M-CSF饥饿处理后不发生显著的细胞凋亡。极化条件下(M1或M2)RNA-seq数据分析表明RIOK3敲除的巨噬细胞倾向与转化为修复型巨噬细胞(M2);RT-qPCR验证了其受IL-4刺激时M2标志性细胞因子Arg 1、Retnla、I110基因表达上调,IFN-γ/LPS联合刺激时I112等细胞因子下调。小鼠全血细胞计数结果显示,RIOK3-/-小鼠的全血各细胞比例与野生型小鼠之间无明显差异。骨髓有核细胞荧光染色结合流式细胞检测结果表明,RIOK3-/-小鼠以及野生型小鼠之间单核树突前体细胞(MDP)、单核细胞祖细胞(cMoP)、单核细胞及其亚群所占比例均无显著性差异。在M-CSF诱导单核细胞成熟分化过程中,标记巨噬细胞成熟的标志并经流式细胞检测,结果表明两组小鼠间成熟细胞所占总细胞比例及各个指标的平均荧光强度均无明显差异。结论:RIOK3可抑制巨噬细胞增殖,促进其凋亡,抑制M2型极化,抑制相关基因Arg1、Retnla、I110的表达;RIOK3不影响巨噬细胞的分化成熟。第二部分RIOK3调控巨噬细胞增殖作用的机理研究目的:解析RIOK3调控巨噬细胞增殖作用的分子机制。方法:取骨髓来源巨噬细胞,以M-CSF刺激相应的时间,收集细胞提取蛋白,以Westem blot(WB)检测CSF1R的下游通路的活化情况,包括PI3K/Akt信号通路、MAPK/Erk信号通路和NF-kB信号通路。以相应的细胞通路抑制剂验证RIOK3对相关通路的调节作用。以荧光染色结合激光共聚焦显微镜定位实验研究RIOK3与靶蛋白之间的相互作用,并以免疫共沉淀实验加以验证。结果:对M-CSF活化通路的WB实验结果表明,RIOK3敲除的巨噬细胞PI3K、Akt磷酸化水平增加,Erk磷酸化水平没有改变。免疫荧光共聚焦实验表明,RIOK3与CSF1R不存在明显的共定位。CSF1R染色结合流式细胞检测实验结果表明,RIOK3敲除与否不影响巨噬细胞表面CSF1R的总表达、内吞和降解。RIOK3与PI3K(p85亚单位)存在细胞质内共定位。以PI3K(p85亚单位)蛋白为诱饵,WB可检测到RIOK3蛋白,RIOK3与PI3K共沉淀。结论:RIOK3通过与PI3K(p85亚单位)结合,抑制M-CSF刺激下PI3K磷酸化活化,从而抑制巨噬细胞的增殖;RIOK3不影响CSF1R的表达、内吞和降解。第三部分 巨噬细胞缺失RIOK3对小鼠黑色素瘤的作用目的:通过体内小鼠黑色素瘤建模进一步探索RIOK3缺失的巨噬细胞对黑色素瘤侵袭转移和预后的影响。方法:取6-8周雌性小鼠,设立RIOK3-/-实验小鼠组和野生型对照小鼠组,于背部皮下注射B16-F10细胞造模黑色素瘤,每2-4天记录肿瘤大小。14天后收获原位肿瘤,胶原酶消化肿瘤组织制备单个悬浮细胞,荧光抗体标记不同类型的免疫细胞后流式细胞实验检测淋巴细胞、巨噬细胞等在肿瘤中的比例,并用免疫组化染色肿瘤组织进一步验证巨噬细胞在肿瘤中的比例。从单个悬浮细胞群中,流式筛选标记HMB45+MART1+的黑色素瘤细胞,提取RNA,进行RNA-seq,比较两组黑素瘤细胞在转录组水平上的差异表达基因(DEGs),并通过功能分析预测造成肿瘤进展的基因簇分类。另取小鼠,尾静脉注射B16-F10细胞,建立黑素瘤体内肺转移模型,12天后取小鼠全肺观察肿瘤转移情况。结果:RIOK3-/-小鼠原位黑色素瘤明显大于对照组,其肿瘤组织中巨噬细胞的比例明显增多。巨噬细胞亚群分类检测提示两组间M1和M2分型的TAMs(Tumor-associated macrophage)没有明显的比例差异。黑色素瘤细胞的RNA-seq结果提示,RIOK3-/-小鼠原位肿瘤中的黑素瘤细胞具有更高的侵袭性。小鼠体内肺转移模型提示,RIOK3-/-小鼠远处肺转移病灶显著增多,体重明显下降,预后较差。结论:巨噬细胞缺失RIOK3对黑色素瘤的疾病发展具有促进作用。RIOK3可能通过抑制恶性黑色素瘤组织内肿瘤相关巨噬细胞的浸润数量,抑制肿瘤的浸润和转移。