论文部分内容阅读
目的:明确DADS上调miR-7表达的作用,为胃癌发生发展提供理论基础和实验依据。阐明DADS能够上调miR-7,从而调控EGFR-Rac1-Pak1通路逆转EMT抑制胃癌细胞迁移侵袭的分子机制,为证实miR-7是DADS的关键靶点提供证据。方法:miR-7沉默慢病毒感染SGC-7901细胞,建立稳定感染的miR-7沉默SGC7901细胞系,同时建立感染慢病毒的阴性对照组。光镜下观察DADS处理后,各组SGC7901细胞形态的改变。DADS处理SGC-7901、vector/SGC7901以及antago-miR-7/SGC7901后,采用MTT、划痕实验与Transwell侵袭实验检测DADS与miR-7沉默对SGC-7901细胞增殖、迁移侵袭的影响。q RT-PCR检测DADS处理前后SGC-7901细胞miR-7的表达,细胞免疫荧光、q RT-PCR、Western Blot检测DADS与miR-7沉默对SGC-7901细胞EGFR、RAC-1、PAK-1、E-cadhein、Vimentin表达的改变。结果:1.成功构建稳定miR-7沉默SGC-7901细胞。将miR-7沉默慢病毒及阴性对照慢病毒分别感染SGC-7901细胞,q RT-PCR显示,感染后较未感染组miR-7明显下调(P<0.05)。表明成功建立稳定miR-7沉默SGC-7901细胞。2.DADS与沉默miR-7对SGC7901细胞形态的影响。相差显微镜观察显示,沉默miR-7组细胞明显较SGC7901组形态明显不规则,异型性大,呈长梭形。DADS处理后各组细胞异型性明显降低,形态变圆。表明DADS可抑制EMT,沉默miR-7可促进EMT。3.DADS对miR-7沉默SGC-7901细胞增殖的影响。MTT结果显示,随着时间的延长,各组细胞的活细胞增多,SGC7901、vector、miR-7-antago、SGC7901+DADS、vector+DADS、miR-7-antago+DADS各组在0小时OD值分别为0.217±0.008、0.201±0.017、0.219±0.017、0.202±0.024、0.220±0.019、0.207±0.016;72小时OD值分别为1.084±0.014、1.084±0.010、1.304±0.011、0.698±0.008、0.702±0.010、0.890±0.015。表明沉默miR-7可促进SGC-7901细胞的增殖,DADS抑制SGC-7901细胞增殖,DADS可抑制沉默miR-7促进增殖作用。4.DADS对miR-7沉默SGC-7901细胞迁移侵袭的影响划痕实验显示,SGC7901、vector、miR-7-antago、SGC7901+DADS、vector+DADS、miR-7-antago+DADS各组的迁移率(%)分别为16.8±1.2、15.7±0.7、33.3±1.6、8.4±0.9、5.2±0.8、14.9±1.7。Transwell侵袭结果显示,SGC7901、SGC7901+DADS、vector、vector+DADS、miR-7-antago、miR-7-antago+DADS各组的穿膜细胞数分别为81.8±5.8、50.6±5.2、78.8±5.8、49.6±8.4、138.8±5.1、98.8±2.6。表明miR-7沉默SGC-7901细胞的迁移与侵袭能力增强(P<0.05),而DADS处理后SGC-7901细胞的迁移与侵袭能力减弱(P<0.05),并且DADS可减弱沉默miR-7促肿瘤迁移与侵袭能力。5.DADS对各组细胞miR-7、EGFR、RAC-1与PAK-1表达影响q RT-PCR显示,DADS处理各组SGC-7901细胞后较未处理组miR-7表达明显上调(P<0.05)。q RT-PCR与Western Blot结果显示,miR-7沉默组EGFR、RAC-1与PAK-1表达明显上调(P<0.05)。DADS处理各组SGC-7901细胞后较未处理组EGFR、RAC-1与PAK-1表达明显下调(P<0.05)。免疫荧光显示,miR-7沉默组EGFR、RAC-1与PAK-1荧光强度增加,DADS处理后EGFR、RAC-1与PAK-1荧光强度减弱,结果与q RT-PCR与Western Blot检测结果一致。6.DADS对各组SGC-7901细胞EMT相关表达的影响。Western Blot结果显示,miR-7沉默组Vimentin蛋白表达较对照组与空载体组增加,而E-cadherin的表达下降(P<0.05)。DADS处理24h后,Vimentin蛋白均较处理前各组表达下调,而E-cadherin的表达增加(P<0.05),表明miR-7沉默可上调Vimentin蛋白,并且可下调E-cadherin蛋白;而DADS则下调Vimentin蛋白,并且可上调E-cadherin蛋白(P<0.05)。免疫荧光显示,miR-7沉默组Vimentin荧光强度增强,而E-caherin荧光强度减弱,而DADS处理后,沉默组Vimentin荧光强度减弱,而E-caherin荧光强度增强,结果与q RT-PCR与Western Blot检测结果一致。结论:1.DADS可上调miR-7调控EGFR/RAC1/PAK1通路抑制SGC-7901细胞EMT与迁移侵袭。2.miR-7沉默可促进SGC-7901细胞的EMT与迁移侵袭,减弱DADS对SGC-7901细胞的EMT与迁移侵袭的抑制作用。