流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,四次大流感的暴发和每年季节性流感的传播严重威胁着人类健康并造成重大经济损失,不时突现的高致病性禽流感时刻警示人类新一轮大流感暴发的潜在性。由此,流感病毒的不可预测性及其致病性致使防控流感成为研究的重点与难点。鉴于疫苗研发相对滞后,以流感病毒神经氨酸酶(NA)抑制剂为代表的抗病毒药物成为迄今抵抗流感最有效的策略。NA的主要功能是促使新生病毒颗粒释放并帮助病毒粒子在呼吸道粘液中迁移。A型流感病毒NA的9种亚型依据一级结构序列可分为两组：第一组(N1,N4,N5和N8)和第二组(N2,N3,N6,N7,N9)；近期新发现一种N10亚型,与前两组NA差异较大。随着对NA晶体结构的解析和酶活机制的了解,Zanamivir (Relenza(?)中文名：瑞乐沙)和Oseltamivir (Tamiflu(?)中文名：达菲)等靶向NA的竞争性抑制剂被成功设计并开发成药物,这一里程碑式的抗流感药物研究被视为基于结构的药物设计的成功范例。然而,Zanamivir口服生物利用率低,造成给药不便；且随着给药的增多,Oseltamivir耐药毒株频现。这些缺陷使现有药物的使用面临瓶颈,新型抑制剂的研发需求迫切。本文主要利用结构生物学及生化手段开展了以下三方面的工作,为新型神经氨酸酶抑制剂的开发提供必要的理论依据：1)解析新型NA蛋白晶体结构；2)系统分析评价新型NA抑制剂的效果并探明其结构基础；3)研究NA对现有药物的耐药机制。首先,2009甲型H1N1大流感暴发后,本课题组在第一时间内通过杆状病毒系统表达及纯化了2009大流感病毒典型毒株的神经氨酸酶头部区域重组蛋白(09N1),并解析了其晶体结构。我们发现09N1(从序列上属于第一组)缺乏传统认为的第一组NA所特有的150-洞,这对经典的NA分组观点提出了挑战,因而我们将09N1归为非典型的第一组NA成员。此后通过结构证明09N1虽不具备150-洞,却可结合靶向150-洞的第一组NA特异性抑制剂IG-173,被IG-173“撑开”形成残缺的150-洞,再次证明了09N1的特殊性。进一步对09N1突变体的晶体结构及分子动力学模拟研究,揭示了09N1的149位氨基酸由Ile(第二组NA常见)突变为Val(第一组NA常见)后增加了150-环链的柔性。其次,近期新型抗流感病毒NA药物Laninamivir (Inavir(?))及其前药CS-8958在日本被批准使用,CS-8958具有长效保护机制,每周仅需一次给药。我们系统分析评价了蛋白水平下四种NA药物(Laninamivir, CS-8958, Oseltamivir和Zanamivir)对不同组别NA的抑制活性,主要包括典型的第一组NA(N5),典型的第二组NA(N2)和非典型的第一组NA(09N1),并利用X射线晶体衍射手段阐明了四种药物与NA作用的结构基础。结果显示Laninamivir对各组NA都有很强的抑制能力,且其抑制作用表现出组的偏好性,即对第一组NA的抑制效果更好。同时,我们首次发现了CS-8958与09N1及N2的作用方式差异明显,更为重要的是CS-8958/09N1表现出与NA/Oseltamivir类似的结合模式,这为Oseltamivir与不同组NA结合和耐受机制提出了新的视角。这些结果对Laninamivir及其前药CS-8958的推广有指导意义。另外,我们还对一种新型NA抑制剂MS-257(在Oseltamivir carboxylate骨架基础上引入了Zanamivir的C4-胍基)对NA的抑制效果和结合模式进行了详细分析,MS-257可高效抑制多种流感病毒的NA重组蛋白,且对09N1H274Y突变株效果比Oseltamivir高约8倍,进一步探究其结构基础,MS-257的4-胍基比Oseltamivir的4-氨基与NA结合更紧密,故对09N1H274Y的抑制效果更好。这些结果为MS-257的进一步开发提供了有利依据。此外,为全面系统分析A型流感病毒各种亚型NA的结构和功能特点,预防潜在的大流感暴发,本研究还开展了对猪流感毒株N3和高致病性禽流感毒株N7以及新型N10的研究。对N3的序列和结构分析表明,不同于其它第二组NA,N3具有第一组NA特有的Y252残基,且该残基被认为是致使N1H274Y突变体产生Oseltamivir耐药的关键因素。而体外活性实验表明,N3H274Y突变体并未对Oseltamivir产生耐药。进一步解析N3H274Y突变体及其与多种药物的复合物结构,我们发现了不同于N1突变体的独特Y274及W295构象。系统的结构比较揭示了造成这一构象差异的两个关键因素：240-环链,270-环链和290-环链间的氢键作用网络强弱差异,以及W295与296位氨基酸能否形成π-π相互作用。据此,我们提出了N1H274Y突变会导致Oseltamivir耐药,而N3H274Y突变不会造成Oseltamivir耐药的全新分子机制。N7和N10是最后两个结构未知的A型流感病毒NA,现已成功表达纯化出N7和N10重组蛋白并筛选出蛋白晶体,体外酶活实验显示N10无神经氨酸酶活性。总之,本研究阐明了多种新型流感病毒尤其是2009甲型H1N1大流感病毒神经氨酸酶的结构,发现了它缺乏第一组NA所特有的150-洞；探明了多种新型NA抑制剂如Laninamivir和MS-257的体外抑制效果及与NA结合的结构基础；刘Oseltamivir耐药的分子机制提供了新的解释。这些结果为研制和开发新型NA抑制剂提供了重要的理论基础,对于流感的预防和控制具有重要意义。