论文部分内容阅读
目的：1，从人的脐带组织中分离和培养脐带间充质干细胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUC-MSCs），并对hUC-MSCs的生物学特性进行研究；2，构建共同表达人IDO基因和增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）基因的慢病毒表达载体，并进行慢病毒颗粒的包装，纯化，浓缩及滴度测定；3，以EGFP作为报告基因，筛选慢病毒转染hUC-MSCs最佳MOI值；研究携带重组IDO基因慢病毒颗粒转染hUC-MSCs后，基因及蛋白表达的情况，并对转染后的hUC-MSCs的生物学特性进行探讨。为进一步利用基因修饰的间充质干细胞对再障小鼠模型的治疗打下基础，为再生障碍性贫血的治疗寻找新的途径。方法：1，采用组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞，培养2周后得到贴壁细胞，倒置相差显微镜下观察细胞形态，细胞计数绘制细胞生长曲线；应用流式细胞仪鉴定细胞表面标志；化学染色检测体外诱导成脂和成骨分化的能力；2，设计相应引物，从含有人IDO基因的cDNA文库中，利用PCR方法钓取人IDO基因的全长编码区片段。将目的因与经酶切线性化的慢病毒表达载体GV218-EGFP进行定向的连接，将产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落PCR鉴定并对阳性的克隆进行测序及比对分析。重组慢病毒表达载体质粒及辅助包装质粒共转染293T细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况；实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度。3，取足月儿脐带以组织块贴壁培养法分离培养hUCMSCs，以不同的感染复数（multipleofinfection，MOI，分别为0、10、20、30、50、100）的重组慢病毒感染hUC-MSCs，通过报告基因EGFP的表达筛选最佳MOI；用IDO重组慢病毒以最佳MOI值感染hUC-MSCs作为实验组，以空载体转染的hUC-MSCs（空载体组）及未转染的hUC-MSCs（空白组）作为对照，应用RT-PCR及Westernblot法分别检测细胞中IDOmRNA及IDO蛋白水平的表达情况。结果：1，体外培养8-10d左右，细胞从组织块中爬出；细胞传代培养至第10代，无明显形态及增增殖能力改变；细胞阳性表达CD44，CD73，而CD34表达阴性。体外诱导实验证实，hUC-MSCs具有成脂及成骨分化的能力。2，经PCR及基因测序鉴定GV218-EGFP-IDO重组慢病毒表达载体构建成功，包装慢病毒Lentivirus-IDO滴度为2×108TU/mL。3，分别以不同MOI值的重组慢病毒感染hUCMSCs后，通过EGFP表达的阳性细胞数筛选其最适MOI为30，此时对细胞的转染效率可达到80%以上。RT-PCR检测显示实验组IDOmRNA表达阳性，空载体组和未转染组均为阴性；Westernblot检测示实验组细胞内IDO蛋白表达阳性，空载体组和未转染组均为阴性。结论：1,体外成功分离与培养了hUC-MSCs，具有间充质干细胞生物学特性；2,成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒载体；3，筛选出最佳MOI值为30，携带重组人IDO基因慢病毒颗粒感染hUC-MSCs后，其在基因及蛋白水平均阳性表达IDO。