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第一部分 GST蛋白变复性的研究
蛋白质变复性的研究具有很重要的意义,我们纯化了GST蛋白并以此为模型,运用多种技术对GST蛋白的变复性进行了研究。
1、GST蛋白亲和层析介质的制备及GST蛋白的表达纯化
以Sepharose4B为原料,在强碱性条件下用1,4-丁二醇二缩水甘油醚活化,再与谷胱甘肽溶液反应,通过条件优化实验,得到最佳GST蛋白亲和层析介质。此法制得的亲和介质具有很高的特异性,纯化效果很好。其亲和吸附能力达到4.2mg/ml,远高于用环氧氯丙烷为活化剂制备的亲和介质,与相应国外商品化介质的性能相近。使用该介质,我们获得了纯度超过90%的GST蛋白。
2、GST蛋白热变性过程的研究
我们以GST蛋白为模型,联用CD,DSC,荧光分析,蛋白质计算机模拟,UV,HPLC,凝胶电泳等多种技术,研究热变性过程中蛋白质结构上的变化行为,结合变性过程中蛋白质活性的变化,探讨了GST蛋白的热变性机理。发现GST蛋白的变性失活温度为51—59℃。随着温度的升高,GST蛋白结构发生了显著的改变,二级结构中β折叠所占的比率明显增高,并且蛋白的疏水可及表面增加,同时GST蛋白的活性二聚体形式被破坏,并形成多聚体,导致GST酶活的丧失。
3、分子印迹聚合物介导GST蛋白复性的研究
分子印迹技术的研究主要针对特定分子的识别、分离与催化。我们将该技术应用于蛋白质变复性研究,发现分子印迹聚合物对变性蛋白的复性有明显的辅助作用。在对变性的GST蛋白进行复性研究中,与空白聚合物、BSA蛋白分子印迹聚合物相比,GST蛋白分子印迹聚合物能够显著提高变性GST蛋白的复性效率。
同时我们还发现GST蛋白分子印迹聚合物在提高GST蛋白的复性效率过程中可以重复使用,从而使其在工业上的应用具有更大的可能性。
第二部分 ZZ蛋白亲和介质的制备和应用
目前在纯化IgG抗体和免疫检测中常用的工具是Protein A亲和介质,Protein A由天然金色葡萄球菌中分离获得,因此价格昂贵,而且Protein A与IgG的结合有一定的限制。ZZ蛋白是一个根据Protein A的B结构域人工合成的一个IgG抗体Fc片段结合蛋白,在免疫检测和纯化IgG方面有着巨大的应用潜力。本文中,在T7启动子的控制下,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了N端带有6个组氨酸标记物的重组ZZ蛋白,经过一步Ni-琼脂糖亲和层析,获得了较高纯度的重组ZZ蛋白,表达量约为50mg/L。将ZZ蛋白通过1,4-丁二醇二缩水甘油醚偶联到Sepharose 4B上制得ZZ亲和介质,该亲和介质可以用于IgG抗体的特异性亲和纯化,并且在免疫共沉淀实验中表现良好,具有和Protein A亲和介质相近的性能。因为ZZ蛋白易于表达纯化且表达量很高,相对与ProteinA价格低廉,可以预期在不久的将来ZZ蛋白有着广阔的应用空间。