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胆固醇是一种非常重要的脂类疏水小分子,它不仅是生物细胞膜的关键组成成分,也是生命体必需的胆汁酸、甾醇类激素等合成的前体原料。人体内胆固醇水平过高或过低都非常有害,严格调控体内胆固醇代谢平衡是维持正常生命活动所必须。 随着人民生活水平的提高和饮食结构的转变,人体越来越多地从饮食中摄取大量的胆固醇。由于胆固醇摄入过多引发的高血脂和脂肪肝等疾病,已经成为危害人类健康的重要因素。 Niemann Pick C1 Like1(NPCIL1)是肝肠胆固醇吸收的关键蛋白。NPCIL1能够结合胆固醇并通过网格蛋白(Clathrin)介导的内吞作用,携带胆固醇进入细胞。结构预测和生物信息学分析表明,NPCIL1是具有13次跨膜结构域的疏水膜蛋白。基于这一预测的结构,构建了一系列插入Myc标签的重组NPCIL1,用于鉴定其拓扑结构。利用胰酶消化保护和选择性通透细胞膜结合免疫荧光实验,确定NPCIL1是一个具有13次跨膜区段的疏水膜蛋白。它的NH2端朝向腔内,它的COOH端朝向细胞质面。NPCIL1的跨膜区3-7是甾醇敏感结构域(SSD),该序列与NPC1,HMGCR,SCAP等中的SSD具有较高的同源性。此外,NPCIL1包含有2个较大的朝向腔内的环状结构域和6个较小的朝向胞质面的环状结构域。还对NPCIL1胞质面区段进行缺失突变,试图寻找参与NPCIL1内吞并结合AP2的关键氨基酸序列。 胆固醇在细胞内的运输是动态平衡的。胆固醇运输异常会引发多种疾病。Niemann-Pick type C(NPC)疾病致病原因是由于编 NPC1或者NPC2的基因发生了突变,导致胆固醇在晚期内吞体和溶酶体中大量堆积,引起神经细胞退行性死亡。为了深入揭示胆固醇在细胞内运输的分子机制,利用化合物库、体细胞遗传学诱变和shRNA文库筛选参与细胞内胆固醇运输的关键蛋白质。目前已经获得一些候选蛋白因子并正在进行深入研究。还利用免疫共沉淀结合串联质谱分析,鉴定出一些潜在的与NPCI相互作用的蛋白。利用RNAi方法降低这些候选基因的表达,发现有6个基因被knock down后,出现不同程度的胆固醇在细胞中堆积的表型,提示这些蛋白可能参与NPC1介导的细胞内胆固醇运输。从这6个基因中选取UBE3A进行进一步的研究。在细胞中,UBE3A被knockdown后,LDL来源胆固醇从溶酶体向其它细胞器运输变慢,导致胆固醇堆积在溶酶体中。然而在UBE3A基因敲除小鼠来源的原代细胞中,并没有观察到与在细胞中相似的表型。NPC1与UBE3A的关系还需要深入研究。 综上所述,NPC1L1拓扑结构的解析有助于深入研究NPCIL1介导的胆固醇吸收的分子机制。NPC1及其相互作用蛋白的鉴定能够丰富人们对胆固醇在细胞内运输的认识。两部分工作在细胞水平阐明了胆固醇的动态平衡。