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本研究的目的是：1.寻找一种有效的基于基因序列同源性的PCR筛选双壳类抗菌肽(AntimicrobialPeptide，AMP)基因的方法。2.应用改良3cDNA末端快速扩增PCR法(RapidAmplificationofcDNAEnds，RACE)和5RACE法，进行筛选扇贝抗菌肽基因的初步研究。
[方法]
1.改良3RACE法从扇贝血淋巴筛选抗菌肽基因
(1)从扇贝血淋巴中提取总RNA。利用M13和T7启动子分别修饰的基因特异性引物(GeneSpecialPrimer，GSP)和锚定引物，对扇贝血淋巴总RNA进行RT-PCR初步扩增，其后再利用M13和T7启动子序列进行嵌套PCR扩增。
(2)3RACE扩增产物经柱纯化后克隆至pGEM-TEasy载体，筛选阳性克隆进行DNA序列分析。
(3)获得的cDNA3端序列通过BLAST程序与GenBank中的抗菌肽基因进行同源性比较分析。
(4)根据测序结果，对感兴趣的基因片段设计另一个基因特异性引物，进行5RACE，扩增该基因cDNA的5端序列。
(5)5RACE扩增得到的5端序列克隆至pCR4-TOPO载体，筛选阳性克隆进行DNA序列分析。
(6)所得cDNA准全长序列应用BLAST程序与GenBank中的抗菌肽基因进行同源性比较分析。
2.改良5RACE法从扇贝血淋巴筛选抗菌肽基因
(1)从扇贝血淋巴中提取总RNA。
(2)根据贻贝抗菌肽MGDs的保守序列设计基因特异性简并引物，进行改良5RACE钓取可能抗菌肽基因cDNA的5端序列，克隆至T载体，筛选阳性克隆进行DNA序列分析。
(3)所得cDNA5端序列应用BLAST程序与GenBank中的抗菌肽基因进行同源性比较分析。
[结果]
1.采用改良3RACE法从扇贝血淋巴RNA中钓取得到多个未知基因的cDNA3端序列，其长度在200bp～800bp之间。
2.改良3RACE产物成功克隆至pGEM-TEasy载体，挑选部分阳性克隆进行DNA序列分析，获得了4个未知基因的3端序列。搜索GenBank核酸数据库，未发现与之高度同源的基因。
3.5号阳性克隆插入基因进行5RACE扩增和克隆，挑选阳性克隆测序后获得长度为448bp的插入基因5端序列。5端序列和3端序列经过拼接得到的5号克隆插入基因cDNA准全长序列，其长度为544bp。
4.搜索GenBank核酸数据库，未发现与5号阳性克隆插入基因准全长cDNA高度同源的基因。
5.采用改良5RACE从扇贝血淋巴RNA中钓取得到多个未知基因的cDNA5端序列。
6.在改良5RACE产物中挑选长度在600bp以下的三个基因片段进行AT克隆，筛选出阳性克隆并进行DNA序列分析，得到3个插入片段序列，其长度分别为257bp、275bp和511bp。通过BLAST程序搜索GenBank核酸数据库，未发现与之高度同源的基因。
[结论]
1.从扇贝血淋巴中获得的1个准全长cDNA、3个cDNA的3端部分序列和3个cDNA的5端部分序列均可能属于新的基因。
2.应用改良RACE方法能钓取含抗菌肽保守序列的新基因片段，表明此方案具有可行性。