论文部分内容阅读
骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类具有多向分化潜能(Multiple differentiation potentiality)的成体干细胞,能向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞以及肌细胞等方向进行分化。因其具有取材方便、增殖快速、低免疫原反应、能够分化为多种细胞、分泌多种生物活性因子以及向损伤组织迁移等优点,目前成为细胞、基因治疗以及组织工程等领域方面的研究热点。在细胞治疗和组织修复的研究中,BMSCs的诱导分化显得尤为重要。BMSCs处于复杂的流体微环境中,许多研究证明力学因素在BMSCs的分化过程中起着重要的作用。力生长因子(Mechano-growth factor,MGF)是近年来新发现的组织受损或受力学刺激过程中表达的一种胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor,IGF-1)选择性剪接变体。实验证明MGF及MGF E结构域24肽(羧基端24肽,MGF-E)在保护受损组织和细胞、促进损伤修复方面起重要的作用。目前,已有关于MGF在细胞分化方面的研究,但MGF在人骨髓间充质干细胞(h BMSCs)的分化过程中起着怎样的作用尚不清楚。本文首先研究了MGF-E对h BMSCs增殖和迁移的影响,在此基础上着重研究MGF及MGF-E对h BMSCs分化的影响,继而研究何种因素在MGF-E诱导h BMSCs的分化过程中起主要调控作用。本文的主要工作和研究结果如下:①MGF-E对h BMSCs增殖和迁移的影响首先,通过可控的FX-4000T细胞应力加载系统对h BMSCs施加12%,1 Hz的等双轴周期性力学刺激,利用Real time RT-PCR(Real time Reverse Transcription–Polymerase Chain Reaction)技术检测MGF-E的表达。结果显示,力学加载并未对MGF-E基因的表达产生影响。随后,检测外源性添加MGF-E对h BMSCs细胞增殖和迁移的影响。结果显示MGF-E对细胞的增殖速率具有一定的延缓作用。Transwell和创伤愈合实验检测显示25 ng/m L和50 ng/m L的MGF-E能明显促进细胞的迁移,100 ng/m L的MGF-E与对照组相比细胞的迁移没有明显变化。RT-PCR与Western blot实验结果显示MGF能促进环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)m RNA和蛋白的表达,COX-2抑制剂NS-398能延缓MGF诱导的细胞迁移速率,说明MGF可能通过诱导COX-2的表达促进h BMSCs的迁移。以上实验结果表明力学加载并未对h BMSCs中MGF的表达产生影响;外源性添加MGF-E能促进细胞的迁移,延缓细胞的增殖速率。②MGF-E对h BMSCs向成骨、成脂肪及成软骨方向分化的影响 为研究MGF-E对h BMSCs分化的作用,分别配制成骨、成脂肪及成软骨诱导分化培养基并作为对照组,以加入20 ng/m L MGF-E的诱导分化培养基为实验组,分别进行了成骨、成脂肪及成软骨方向分化的检测。培养过程中诱导分化培养基每三天更换一次,MGF-E每天添加一次。实验结果如下:1)通过碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性检测,ALP染色和茜素红染色(Alizarin Red S staining)研究了MGF-E在h BMSCs向成骨分化中的作用。2)通过油红O(Oil Red O)染色以及RT-PCR技术研究了MGF-E在h BMSCs向成脂肪分化中的作用。3)通过免疫荧光染色及酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)技术研究MGF-E在h BMSCs向成软骨方向分化中的作用。以上实验的研究结果表明分别向成骨、成脂肪、成软骨分化诱导培养基中添加MGF-E能显著促进h BMSCs向成骨、成脂肪、成软骨方向分化,这为后续的研究提供了基础依据。③过表达MGF对hBMSCs向成骨及成脂肪方向分化的影响为进一步研究MGF在h BMSCs分化中的作用,由Invitrogen公司构建含有MGF基因的质粒,转入大肠杆菌中扩增,随后转染到h BMSCs中。将转染MGF基因的h BMSCs分别在成骨分化诱导培养基和成脂肪分化诱导培养基中培养,以空白质粒为对照,分别进行茜素红和油红O组织化学染色。RT-PCR实验结果显示转染后的h BMSCs中MGF的表达明显升高。成骨诱导分化培养7天后,茜素红染色显示诱导后的细胞产生大量钙沉积;成脂肪诱导分化培养7天后,油红O染色结果显示诱导后的细胞含有较多的脂肪油滴。以上实验结果表明MGF转染后的h BMSCs分别在成骨、成脂肪分化诱导培养基中培养后其向成骨、成脂肪细胞分化的能力明显增强。④MGF-E通过延迟细胞周期促进h BMSCs的分化为研究MGF-E诱导h BMSCs分化的调节机制,利用流式细胞技术(Flow cytometry assay)检测MGF-E对细胞周期的影响,并通过RT-PCR技术检测相关周期蛋白Cyclin E和cyclin-dependent kinase(CDK2)的表达情况。流式检测结果显示生长培养基中添加MGF-E 24小时后,G1期细胞数量明显增加,说明MGF-E将细胞周期阻滞在G1期,G1期时间延长。RT-PCR结果显示MGF-E处理24小时后细胞周期蛋白Cyclin E、CDK2 m RNA表达水平明显下降。以上实验结果表明MGF-E可能通过减少细胞周期蛋白Cyclin E、CDK2的表达,将细胞周期阻滞在G1期,从而向有利于细胞分化的方向发展。综上所述,本文研究了周期性力刺激对hBMSCs中MGF表达的影响,MGF-E对细胞增殖、迁移的影响,并着重研究了MGF在h BMSCs分化中的作用。结果表明MGF能促进h BMSCs的迁移,并通过延迟细胞周期促进h BMSCs的分化。这为MGF在细胞治疗和组织工程中的应用提供了一定的理论依据。