论文部分内容阅读
哺乳动物细胞表达系统具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化蛋白药物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近天然蛋白分子，是目前重组糖蛋白药物生产的首选体系。对于较复杂的分子如基因工程抗体，以及基因治疗用病毒载体，哺乳动物细胞更是首选的表达宿主。但哺乳动物细胞表达系统的缺点也很明显，如表达量低、大规模培养困难、生产成本高昂等。一株成功的工程细胞除了要求目的蛋白的表达量高外，还必须适应无血清培养基培养；必须具有对不利环境的抵抗能力，即抗凋亡能力；对于非直接悬浮培养的细胞，还必须具备在无血清培养条件下的贴壁能力。工程细胞上述能力的获得仅由培养基配方和培养条件优化设计很难实现，必须从工程细胞本身着手，对细胞本身的生理特征进行改造，才有可能实现。鉴于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是目前基因工程制药最常用的哺乳动物宿主细胞，本研究集中对CHO细胞的部分基因进行了过表达或抑制，以期获得上述能力。实验分成四部分： 1．高效哺乳动物细胞表达载体的构建 表达载体对于外源基因的高效表达十分重要。本研究首先构建了含有人延伸因子1α亚基启动子(PEF-1α)和小鼠二氢叶酸还原酶（DHFR）加压扩增基因的表达载体pED5，用于外源基因的常规表达。应用人β-干扰素（IFN-β）和人分泌型碱性磷酸酶（SEAP）基因作为报告基因，对含有巨细胞病毒即早期启动子(PCMV-IE)的表达载体pCdhfr1和pED5表达外源蛋白的能力进行了比较，发现对于瞬时表达，pED5略好于pCdhfr1；在稳定表达中，通过降低血清浓度，使细胞增殖缓慢，这时pED5表达外源蛋白的能力较pCdhfr1高3.1倍。表明PEF-1α启动子受细胞周期时相的影响较小，比较适于外源重组蛋白的稳定表达。 为了进一步提高表达载体表达外源蛋白的能力，我们把两个人工转录激活结构域AH和VP2分别通过一个柔性的Linker融合到λ噬菌体cI蛋白的C末端，构建了两个人工转录激活因子。在pED5载体PEF-1α的TATA框上游约200bp处插入了λ噬菌体的OR2-OR1序列，人工转录激活因子可以结合到此处，而增强启动子转录基因的能力。我们把上述元件都整合进pED5载体中，构建了表达载体pER-AH和pER-VP2。以IFN-β和SEAP报告基因对其表达效果进行检测，结果pER-AH表达外源蛋白的能力仅略高于pERFRT（一个除了不含人工转录激活因子外，其余都与pER-AH或pER-VP2完全相同的载体）。而pER-VP2表达外源蛋白的能力则中文摘要比pE盯RT高2 .7倍。2.抗凋亡工程细胞株CHO一A6的构建 对于在生物反应器中大规模培养的CHO细胞，各种不利因素均可导致细胞凋亡，尤其在低血清或无血清培养基中培养更是如此。在细胞凋亡中，各种凋亡信号以级联方式激活一类称作Caspases的蛋白酶，并且最终激活终端效应蛋白酶CasPase一3。该酶降解一系列底物，从而使细胞不可逆地走向凋亡。由于Caspase一3在细胞凋亡中的中心地位，抑制CasPase一3有可能有效抑制细胞凋亡。本研究中，我们设计了一个核酶，体外实验表明该核酶在Caspase一3开放读码框的45 Ini处可以将其mRNA有效切断。将该核酶置于U6S刊良NA启动子的下游，构建了一个高效核酶表达载体PNco一U6casRZ。应用该载体转染一个稳定表达IFN一p的CHo细胞株Jkss，筛选稳定的G418抗性克隆。应用W七stem Blot对其中的20个克隆进行检测，选出一个Caspase一3表达量最低的细胞克隆A6。流式细胞分析和酶活性测定确认该克隆表达CasPase一3的量较低。通过撤去血清、高密度贴壁培养和加入氨/乳酸等方法对细胞凋亡进行诱导;应用流式细胞术、DNA Ladder法以及原位TUNEL法等对细胞凋亡进行分析，表明A6克隆具有较强的抗细胞凋亡能力。在细胞培养瓶中分别对A6克隆和对照CHO一dhfr-克隆进行低血清连续培养和批次培养实验，结果表明A6细胞的细胞平面密度、活细胞数以及IFN一p的表达量均显著高于CHodhfr.对照细胞。该细胞株可以用于在低血清条件下生产人p一干扰素。3.适于无血清培养的抗凋亡宿主细胞系CHO一IB和CHO一BC的构建 无血清培养基或无蛋白培养基的诸多优点己使之取代了有血清培养基而成为大规模培养CHO细胞的首选培养基。但由于没有血清提供生长因子和其它必需成分，细胞的生长增殖能力较差，而且很容易发生细胞凋亡。胰岛素样生长因子（Igf-l）是一种与胰岛素类似的生长因子，可以促进培养细胞的生长分裂。细胞周期蛋白E（CydinE）是一类Gl期蛋白，在 Gl期表达持续增高，当达到一定量时，便推动细胞周期进入S期。所以CyclinE是细胞生长分裂的促进蛋白。我们试图通过使细胞自身高表达Igf-1或CyclinE而使细胞获得在无血清培养基中高活力生长的能力。为了抑制细胞凋亡，我们在细胞中同时高表达Bd一2蛋白。Bcl一2是一种线粒体膜整合蛋白，通过维护线粒体膜的完整性，阻止细胞色素。（Cyt。）的释放而抑制细胞凋亡。Bd一2的抗凋亡能力在多种生物工程宿主细胞中均得到证明。我们应用双顺反子表达载体在CHOdhfr.细胞中同时表达Igf-l忍cl一2或Bel一2/CyelinE，筛选到G418抗性克隆各20个。应用Westem Blot方法分别筛选