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芥菜(Brassica juncea Coss.)是芸薹属重要的蔬菜作物,栽培多分布于我国长江以南地区,抽薹开花将严重影响其产品器官的产量和品质。前人在拟南芥中的研究表明:大量开花相关基因编织成一个庞大而精密的调控网络,而MADS-box转录因子(如AGL18)在其中有着重要作用。然而迄今为止,芥菜中开花抑制因子AGL18与其他开花时间基因在整个开花调控网络中的关系尚未见报道,AGL18调控芥菜开花时间的分子机制也不清楚。为了阐明芥菜AGL18的作用机制,本研究从芥菜中克隆了AGL18,利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术研究了AGL18与SOC1、AGL24间的蛋白-蛋白互作;并通过酵母单杂交技术和Dual-Glo?双萤光素酶检测系统研究了AGL18与SOC1和AGL24间的蛋白-DNA互作;筛选出了AGL18与SOC1/SOC1和AGL24/AGL24的互作区域,同时又进一步筛选和验证了蛋白互作的关键氨基酸位点;并通过农杆菌介导转化芥菜和烟草,对基因功能作了初步的验证和分析。为深入研究芥菜AGL18对开花时间的影响奠定了基础。主要试验结果如下:1.芥菜AGL18基因的克隆与生物信息学分析试验从苗期和花期芥菜中克隆得到3条AGL18 cDNA序列(花期,AGL18-1;苗期,AGL18-2和AGL18-3),序列分析表明3条序列与十字花科芜菁和油菜的核苷酸序列同源性最高。芥菜AGL18Δ1-3蛋白属于MIKCc型蛋白,分别编码257、257和258个氨基酸,蛋白质量分别为29.01 kD、28.73 kD和29.34 kD,理论等电点为5.65、5.15和5.86,均为不稳定亲水性蛋白。2.芥菜AGL18s蛋白均与SOC1蛋白没有相互作用试验分别以pGADT7-AGL18Δ1-3和pGBKT7-AGL18Δ1-3做为诱饵质粒进行了验证,酵母双杂交试验表明,芥菜AGL18Δ1-3与SOC1蛋白没有相互作用。BiFC试验发现,本氏烟叶片经混合菌液侵染后在激光共聚焦显微镜下无荧光产生,进一步验证了这一结论。3.芥菜AGL18-1蛋白与SOC1启动子互作酵母单杂交表明,只有Y1HGold[(pAbAi-SOC1)×(pGADT7-AGL18-1)]能够在SD/-Leu/AbA100固体培养基上正常生长,说明AGL18Δ1-3蛋白中只有AGL18-1蛋白与SOC1启动子有相互作用。双萤光素酶活性检测表明,试验组萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值显著高于阴性对照组的比值,说明AGL18-1蛋白与SOC1在植物细胞内可以互作。4.芥菜AGL18-1/SOC1的蛋白-DNA互作区域为M域试验已证实只有AGL18-1蛋白与SOC1启动子间存在蛋白-DNA互作,为了进一步筛选出具体的作用区域,试验单独截取M域和IKC域。酵母单杂交技术表明,只有M域截短体与SOC1启动子融合后可以在SD/-Leu/AbA100固体培养基上长出白色菌落,说明M域是发生蛋白-DNA互作的关键部位。5.芥菜AGL18Δ1-3蛋白均与AGL24蛋白互作试验以Y2HGold(pGBKT7-AGL18Δ1-3)为诱饵蛋白,Y187(pGADT7-AGL24)为猎物蛋白,酵母双杂交试验说明AGL18Δ1-3能够与AGL24结合,并激活报告基因ADE2、AUR1-C、HIS3和MEL1。Bi FC试验表明,本氏烟叶片经共侵润液侵染后能够在激光共聚焦显微镜下产生荧光,说明芥菜AGL18Δ1-3蛋白均与AGL24蛋白互作。6.K域是介导芥菜AGL18s/AGL24蛋白互作的关键区域为了进一步筛选AGL18s/AGL24互作的具体区域,试验分别截取了AGL18Δ1-3蛋白的M域、K域、MIK域和KC域截短体。酵母双杂交技术表明,除M域外,其它均与AGL24蛋白存在相互作用,说明了K域是介导AGL18s/AGL24互作的关键区域。7.芥菜AGL18-1蛋白与AGL24启动子互作酵母单杂交表明,只有Y1HGold[(pAbAi-AGL24)×(pGADT7-AGL18-1)]能够在SD/-Leu/AbA100固体培养基上正常生长,说明AGL18Δ1-3蛋白中只有AGL18-1蛋白与AGL24启动子有相互作用。双萤光素酶活性检测表明,试验组萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值显著高于阴性对照组的比值,说明AGL18-1蛋白与AGL24在植物细胞内可以互作。8.芥菜AGL18-1/AGL24的蛋白-DNA互作区域是M域和K域试验单独截取M域、IKC域,K域、MIK域和MK域来筛选互作区域,酵母单杂交技术结果表明,所有截短体均与AGL24启动子存在相互作用;说明M域和K域是AGL18-1/AGL24互作的关键区域。9.芥菜AGL18Δ1-3突变体与AGL24作用位点的筛选试验利用ISIS系统在线预测了AGL18Δ1-3参与蛋白-蛋白相互作用的氨基酸残基位点,成功构建了11个突变体。酵母双杂交、BiFC和β-半乳糖苷酶活性分析表明AGL18-2L113F、AGL18-2E116H、AGL18-2L118F、AGL18-2K165T、AGL18-3L114P、AGL18-3E117G、AGL18-3R118G和AGL18-3L119P等8个突变体与AGL24蛋白仍存在相互作用,但会不同程度的削弱或增强AGL18-2/AGL24和/或AGL18-3/AGL24的互作强度,说明这8个位点不是AGL18-2和AGL18-3蛋白与AGL24蛋白相互作用的关键位点。突变体AGL18-1L114V和AGL18-1E117V均会显著削弱AGL18-1/AGL24的互作强度,但彼此间的相互作用并没有消失,而AGL18-1K190I突变体与AGL24蛋白没有相互作用,表明AGL18-1蛋白第190位氨基酸是AGL18-1与AGL24互作的关键位点。10.芥菜AGL18Δ1-3正反义载体构建及遗传转化为了进一步探究芥菜AGL18Δ1-3基因功能,试验将AGL18Δ1-3全长序列的正、反向分别插入到植双元表达载体pBI121。农杆菌介导芥菜pBI35S::sAGL18Δ1-3和pBI35S::aAGL18Δ1-3转化芥菜及烟草。成功获得100余株转基因烟草材料和30余株转基因芥菜材料,并对转基因芥菜和烟草的表型作了初步观察。