研究背景前列腺癌是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤之一,早期局限性前列腺癌一般采用手术或局部放疗,而晚期多采用内分泌治疗,但随着时间的延长,很多患者发展为去势抵抗性前列腺癌。免疫治疗(疫苗或细胞因子)是治疗肿瘤的有效途径之一。本实验将链亲和素标记的mGM-CSF(SA-mGM-CSF)锚定在生物素化的肿瘤细胞表面,成功制备一种新型肿瘤细胞疫苗。研究表明该疫苗具有较好的疗效,但疫苗治疗后肿瘤微环境中的Treg细胞也明显增加。Treg细胞是一群具有免疫抑制功能的T细胞亚群,参与肿瘤免疫逃逸。因此,抑制或清除Treg细胞必将有效提高抗肿瘤免疫反应。近期研究发现,ICOS+Treg是发挥免疫抑制作用的主要Treg亚群。我们前期的研究发现,体外活化ICOS信号可显著促进Treg细胞的增殖和免疫抑制功能。基于以上研究结果,我们提出设想:采用ICOS封闭性抗体靶向清除Treg细胞,从而提高疫苗的疗效。去甲斑蝥素(NCTD)具有很强的抗肿瘤能力,能抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。NCTD具有区别于普通化疗药物的最显著特点,即NCTD具有升白作用,可减少化疗后的骨髓抑制。近期有报道称,NCTD还具有免疫调控作用,但对Treg细胞的影响报道罕见。研究目的1.探究ICOS封闭性抗体是否可以靶向清除Treg细胞,提高SA-mGM-CSF膜修饰的前列腺癌细胞疫苗的疗效。2.探究NCTD对Treg细胞增殖和凋亡的影响,以及NCTD联合SA-mGM-CSF膜修饰的前列腺癌细胞疫苗治疗小鼠前列腺癌的疗效。研究方法ICOS封闭性抗体联合SA-mGM-CSF肿瘤细胞疫苗治疗前列腺癌:C57BL/6雄鼠的右后腿腹股沟区皮下注射RM-1前列腺癌细胞,建立皮下前列腺癌模型,随后观察成瘤效果并记录肿瘤大小。随机将小鼠分为四组(PBS,Vaccine,Vaccine + IgG mAb 和 Vaccine + ICOS mAb 组),于肿瘤细胞接种后的第12天开始,每隔4天皮下注射一次疫苗,共4次,每隔3天腹腔注射ICOS封闭性抗体100μg,共4次。治疗结束后一周,流式细胞术检测血液中成熟的DC细胞,CD4+、CD8+T淋巴细胞以及ICOS+Treg细胞的含量;免疫组化检测肿瘤微环境中的CD4+、CD8+T淋巴细胞;免疫荧光检测肿瘤组织中的ICOS+Treg细胞以及ELISA检测小鼠血清中的IL-4、IL-10和IFN-γ的含量。NCTD对Treg细胞增殖和凋亡的影响:采用磁珠分选技术获取Treg细胞。活化性的CD3和CD28抗体刺激细胞,并加入不同浓度(0-80μM)的NCTD作用24h或者20μM NCTD作用0-3天。收集各时间点的细胞,CCK8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。提取20μM NCTD处理后的Treg细胞总蛋白和总RNA，western blot和Real Time PCR分别检测凋亡相关蛋白的蛋白水平和基因水平。NCTD联合SA-mGM-CSF肿瘤细胞疫苗治疗小鼠前列腺癌:同上述方法建立动物模型。随机分为四组(PBS,NCTD,Vaccine和Vaccine + NCTD组),于肿瘤细胞接种后的第10天开始,同上方法进行疫苗治疗,同时腹腔注射NCTD 10mg/kg/天，连续14天。治疗结束后同上述方法检测DC细胞,CD4+T、CD8+T淋巴细胞以及Treg细胞的含量。研究结果1..ICOS抗体显著提高SA-mGM-CSF肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤免疫反应。与PBS对照组相比,肿瘤疫苗能有效抑制肿瘤生长,小鼠血液和肿瘤组织中的CD4+、CD8+T淋巴细胞明显增多,但肿瘤组织中ICOS+Treg细胞也明显增多。联合ICOS抗体治疗后,肿瘤体积缩减更快,ICOS+Treg细胞明显减少,血液和肿瘤组织中效应T细胞增加更显著,血清中IL-4和IL-10含量显著降低。2.NCTD体外对Treg细胞的影响。NCTD显著抑制Treg细胞增殖并诱导凋亡,且呈时间、剂量依赖关系。机制研究发现,NCTD能明显下调p-AKT,从而上调FOXO1、FasL蛋白。Fas、FasL、FOX03a、FOX04和FO×O1基因表达水平也明显升高。3.NCTD显著提高SA-mGM-CSF肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤免疫反应。与PBS对照组相比,疫苗或NCTD单独治疗能有效抑制肿瘤生长,小鼠血液和肿瘤组织中的CD4+、CD8+T淋巴细胞。疫苗治疗后Treg细胞明显增多,而NCTD能减少Treg细胞。联合NCTD治疗后,肿瘤体积缩减更快,Treg细胞明显减少,血液和肿瘤组织中的效应T细胞增加更显著。研究结论1.ICOS封闭性抗体可以通过清除ICOS+Treg细胞,显著提高SA-mGM-CSF膜修饰的前列腺癌细胞疫苗的抗肿瘤效果。2.NCTD体外能抑制Treg细胞增殖且诱导凋亡,以及NCTD体内能明显减少SA-mGM-CSF膜修饰前列腺癌细胞疫苗诱导的Treg细胞,显著增强其疗效。