当今药物滥用在世界范围内已成为一种严重的社会公共卫生问题,给社会造成极大的危害。探究药物依赖的机制,开发有效的戒毒药物是法医工作者重要的研究内容之一。阿片类物质是常见的滥用药物,长期使用将导致耐受和依赖。阿片依赖是一种慢性复发性脑病,主要特征为强迫用药、不断增加药物摄入量和停药时出现戒断综合征。最近研究发现许多非阿片受体作用系统可能是阿片依赖防治的重要靶点。胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)作为一种典型的脑肠肽,以神经递质和神经调质的形式发挥着重要作用,并且八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)是目前已知作用强效的内源性“抗阿片肽”之一,通过“负反馈”机制调节阿片耐受和依赖过程。研究显示,CCK受体拮抗剂能逆转吗啡耐受、减轻吗啡依赖大鼠的急性催促戒断症状,抑制吗啡诱导条件位置性偏爱的形成。既往我室研究发现CCK-8能显著抑制慢性吗啡处理后纳洛酮催促戒断引起的“c AMP超射”,皮下注射吗啡前给予CCK-8慢性干预能明显减轻吗啡依赖大鼠的戒断症状,与CCK受体拮抗剂的作用一致;并且CCK-8能明显抑制吗啡诱导条件位置性偏爱的形成和重燃,提示外源性大剂量CCK-8对吗啡躯体依赖、精神依赖及复吸过程有显著调节作用,与内源性CCK的作用并不一致。CCK-8通过CCK受体发挥胆囊收缩、胰酶分泌、延缓胃排空和抑制食欲等生理作用,并与痛觉感受、情绪、记忆、神经保护、中枢呼吸控制和心血管紧张性等功能相关。CCK受体除包括经典的CCK1受体、CCK2/胃泌素受体外,还有CCKC受体、甘氨酸延伸型胃泌素受体(G-Gly受体)及CCK2受体的剪接变异体(CCK-BRi4SV)等。经典的CCK1和CCK2受体均属于G-蛋白偶联受体家族,二者具有50%的同源性。CCK1受体主要分布于外周胰腺腺泡、胆囊、幽门平滑肌等处,在中枢神经系统呈不连续分布,属于低敏感性受体,并且还存在高、低两种亲和状态;CCK2受体是中枢神经系统的主要存在形式,主要分布于大脑皮层基底神经节、纹状体、前下托、扁桃体、伏核、海马、下丘脑、杏仁核、黑质、腹侧背盖区等区域,属于高敏感性受体,CCK-8对CCK2受体的亲和力明显高于CCK1受体。目前研究认为,CCK2受体在痛觉感受、阿片依赖等过程中起主要作用,而与CCK1受体无关。但是,相关研究也显示CCK-8可以通过CCK1受体抑制小鼠的活动性;伏核中后区CCK对学习记忆过程具有促进作用,并且是通过CCK1受体实现的,而CCK2受体不起作用;还有研究者报道CCK受体的不同亚型在动物行为学相关研究中的结果并不一致。因此,CCK受体各种亚型及其不同敏感程度的作用并不一致,同时也决定了CCK生物功能的多样性。我室系列研究结果显示,CCK1、CCK2受体拮抗剂都可阻断CCK-8对阿片受体结合力的抑制。CCK2受体拮抗剂可以抑制吗啡依赖的形成,而CCK1受体拮抗剂无此作用,但其可部分翻转外源性大剂量CCK8对吗啡依赖的抑制作用,CCK2受体拮抗剂则无此作用。所以推断,CCK受体的不同亚型可能对吗啡依赖均具有不同的调控作用,CCK受体的不同作用模式可能是解释外源性CCK-8干预吗啡依赖过程的重要机制。但是我们仅通过两种特异性受体拮抗剂间接证明了两种受体的不同作用,并无直接证据反映其在吗啡依赖过程中的具体功能,使得其结果的分析较为模糊。由于缺少商品化的高选择性CCK1受体的专一配体,能被CCK1受体识别的配体在不同程度上都能被CCK2受体识别。另外,CCK1受体又常和CCK2受体共存于同一组织或细胞中,缺少合适的实验模型对两种受体进行单独研究。因此,本研究的首要内容是建立一种CCK1或CCK2受体单独稳定表达的细胞实验模型,明确CCK受体的不同亚型对吗啡急慢性作用是否具有不同的调控作用;并进一步考察CCK受体两种不同亚型调节吗啡急慢性作用的细胞分子学机制,为CCK-8在吗啡依赖和复吸防治方面的实际应用提供系统、可靠的理论依据。第一部分吗啡受体、CCK1和CCK2受体稳转细胞系的建立目的:构建稳定转染人源μ阿片受体的HEK293-OPRM1细胞系,共同稳定表达人源μ阿片受体和CCK1受体的HEK293-CCK1R细胞系,共同稳定表达人源μ阿片受体和CCK2受体的HEK293-CCK2R细胞系,为进一步研究CCK受体不同亚型对急慢性吗啡作用的影响及机制提供有力的工具。方法:①首先设计含有内切酶Not I的OPRM1-His tag引物对,含内切酶XbaI的His tag–IRES-Ds Red monomer引物对,含内切酶EcoRI的CCK1RV5 tag的引物对,含内切酶Xho I的V5 tag-IRES-EGFP引物对,含内切酶Eco RI的CCK2R-Flag tag引物对,含内切酶Xho I的Flag tag-IRES-EGFP引物对,以不同质粒扩增基因片段,电泳纯化,再以DNA片段OPRM1-His tag和His tag–IRES-Ds Red monomer为模板扩增目的基因片段OPRM1-His tag-IRES-Ds Red monomer,以DNA片段CCK1R-V5tag和V5 tag-IRES-EGFP为模板扩增目的基因片段CCK1R-V5 tag-IRES-EGFP,以DNA片段CCK2R-Flag tag和Flag tag-IRES-EGFP为模板扩增目的基因片段CCK2R-flag tag-IRES-EGFP,电泳纯化,双酶切目的基因片段连入目的载体质粒,转化细菌挑克隆测序验证;②OPRM1质粒转染HEK-293细胞及筛选稳定系,PCR检测细胞中OPRM1基因的表达;③将CCK1R、CCK2R质粒分别导入细胞OPRM1-HEK293混合稳定系细胞中,PCR检测细胞中CCK1R、CCK2R的表达。结果:①构建载体质粒测序结果与NCBI比对,结果与人源MOR受体,CCK1R,CCK2R m RNA序列完全一致;②100μg/ml潮霉素筛选扩增HEK293-OPRM1细胞,荧光显微镜下可见红色荧光,OPRM1基因的表达量是对照组细胞的8287.65倍,说明混合稳转株构建成功;③300μg/ml博来霉素筛选稳定表达的HEK293-CCK1R细胞,荧光显微镜下见绿色荧光,PCR结果表明CCK1R基因表达为对照组细胞的32993.35倍;④300μg/ml博来霉素筛选稳定表达的HEK293-CCK2R细胞,荧光显微镜下可见绿色荧光,PCR结果表明CCK2R基因表达为对照组细胞的970倍;⑤稳转细胞培养十代后,MOR,CCK1R,CCK2R基因仍然高表达。小结:本部分成功构建了P3.1-hygro-OPRM1-Histag-2,P3.1-ZeoCCK1R-V5 tag-1和P3.1-Zeo-CCK2R-flag-1的表达载体,并建立了稳定表达OPRM1的HEK293-OPRM1细胞系;首次建立了共同表达OPRM1和CCK1R的HEK293-CCK1R细胞系,共同表达OPRM1和CCK2R的HEK293-CCK2R细胞系。为下面进一步研究CCK不同受体亚型对MOR受体功能影响奠定了基础。第二部分CCK受体不同亚型对吗啡急慢性作用的影响目的:通过测定急慢性吗啡作用后细胞内c AMP含量的变化,观察CCK受体不同亚型对吗啡急慢性作用的影响,并分别敲减了HEK293-OPRM1细胞的两种CCK受体,观察其对吗啡急慢性作用的影响,以进一步说明两受体对吗啡急慢性作用的影响。方法:①用时间分辨荧光共振能量转移的方法(TR-FRET)测定10μM吗啡与5μM forskolin共同孵育15min、10μM吗啡预处理6h,12h,16h,24h、100μM纳洛酮催促15min后HEK-293细胞,HEK293-OPRM1细胞,HEK293-CCK1R细胞和HEK293-CCK2R细胞内c AMP含量,与对应非吗啡处理组比较;②用小干扰RNA分别敲减HEK293-OPRM1细胞内CCK1R和CCK2R,用TR-FRET法测定10μM吗啡与5μM forskolin作用15min、10μM吗啡预处理4h后细胞内c AMP含量,与转染阴性对照组比较。结果:①在HEK293-OPRM1细胞,10μM吗啡作用15min可以显著抑制5μM forskolin刺激的c AMP增加,100μM纳洛酮可以阻断吗啡的这种抑制作用;10μM吗啡作用4h可以显著增加5μM forskolin刺激的c AMP含量,10μM吗啡处理12h、100μM纳洛酮催促可形成明显c AMP超射;②过表达CCK1和CCK2受体,显著减弱了急性吗啡的抑制作用,以CCK1R为著;③过表达CCK1受体,在10μM吗啡预处理12h,16h,24h完全抑制了100μM纳洛酮催促所致c AMP超射,提示CCK1受体可抑制吗啡慢性作用;④过表达CCK2受体,在10μM吗啡预处理6h,给予100μM纳洛酮催促可形成明显c AMP超射,提示吗啡依赖提前发生,易化了依赖的形成;⑤敲减CCK1受体后,减弱了急性吗啡的抑制作用,而敲减CCK2受体没有影响;在敲减CCK1和CCK2受体后,于慢性吗啡作用4h即出现了纳洛酮催促形成的c AMP超射,以敲减CCK1受体为著,进一步提示CCK1受体的抗吗啡依赖作用。小结:①证实了CCK1受体可减弱急性吗啡对c AMP的抑制作用,阻碍慢性吗啡作用纳洛酮催促戒断引起的c AMP超射,阻断了吗啡依赖戒断的形成;②CCK2受体虽然也能减弱急性吗啡对c AMP的抑制作用,但却可易化慢性吗啡作用纳洛酮催促戒断引起的c AMP超射,促进吗啡依赖和戒断反应,并具有时间依赖性,说明在慢性吗啡作用中两种受体发挥着不同的作用。第三部分CCK受体不同亚型对吗啡急慢性作用的影响机制目的:本部分通过Western Blot的方法监测吗啡作用于稳转细胞系后CREB、ERK1/2的活化及μ阿片受体(MOR)磷酸化变化情况,明确不同CCK受体亚型对吗啡急慢性作用的影响机制。方法:用Western Blot的方法检测吗啡急性、慢性作用HEK-293细胞、HEK293-OPRM1细胞、HEK293-CCK1R细胞和HEK293-CCK2R细胞所引起的p-CREB、CREB、p-ERK1/2、ERK1/2、p-MOR含量变化。结果:①急性吗啡作用(15min),显著抑制了HEK293-OPRM1细胞的p-CREB水平,过表达CCK1和CCK2受体显著减弱了此抑制作用,CCK1受体作用更强;急性吗啡作用显著增加了HEK293-OPRM1细胞的p-ERK1/2水平,过表达CCK1受体拮抗了此作用,过表达CCK2受体对此没有影响;急性吗啡作用显著增加HEK293-OPRM1细胞的p-MOR水平,过表达CCK1和CCK2受体均减弱了影响,CCK1受体作用更显著;②慢性吗啡作用6h,HEK293-OPRM1细胞的p-CREB水平未见变化,仅见p-ERK1/2水平增加;而过表达CCK2受体,p-CREB和p-ERK1/2水平均显著增加;过表达CCK1受体,p-CREB未见变化,p-ERK1/2水平减低;③慢性吗啡作用12h,显著增加了HEK293-OPRM1细胞的p-CREB水平,p-ERK1/2未见变化,而总的ERK1/2下降,提示ERK1/2的活性增加;过表达CCK1受体,降低了p-CREB水平,上调CREB和ERK1/2,降低CREB和ERK1/2的活性;过表达CCK2受体虽未影响p-CREB水平,减弱了CREB下调,CREB的活性降低,但对ERK1/2的活性没有影响。小结:①CCK受体显著减弱急性吗啡对CREB活化的抑制作用,CCK1受体作用更强;CCK1受体抑制了慢性吗啡引起CREB活性上调;CCK2受体可促进慢性吗啡对CREB活性上调,但随着时间的延长,作用逐渐减弱,呈时间依赖性;②CCK1受体拮抗了急慢性吗啡引起的ERK1/2活性的增强,CCK2受体不影响急性吗啡对ERK活性的调节作用,而促进了慢性吗啡对ERK1/2活性调节;③CCK1,CCK2受体显著减弱急性吗啡引起的p-MOR,其中CCK1受体作用更强。结论：1成功构建了稳定表达MOR的HEK293-OPRM1细胞系;首次构建了稳定共表达MOR和CCK1受体的HEK293-CCK1R细胞系,及稳定共表达MOR和CCK2受体的HEK293-CCK2R细胞系。2首次直接证实CCK1受体可抑制吗啡急慢性作用;CCK2受体可抑制吗啡的急性作用,但易化了吗啡依赖的形成,并具有时间依赖性,说明在慢性吗啡作用中两种受体发挥着不同的作用。3 CCK1受体通过抑制急性吗啡对CREB和ERK1/2的调节抑制了吗啡急性作用;CCK2受体仅抑制急性吗啡对CREB的调节,对吗啡急性作用抑制较弱。CCK1受体通过阻断慢性吗啡上调CREB和ERK1/2阻断了吗啡慢性作用;CCK2受体通过易化吗啡慢性作用对CREB和ERK1/2的上调,易化了吗啡慢性作用。4过表达CCK受体可抑制急性吗啡引起的MOR磷酸化,以CCK1受体作用最为显著。