肾移植是目前终末期肾病患者最理想、最经济的一种治疗方法,但移植后排斥反应严重影响着移植物及受者的存活。目前,移植肾活检是能明确诊断排斥反应的唯一方法,但此法即昂贵又不方便还易引起肾损伤导致各种并发症。因此新的有效、方便、无创伤的排斥反应早期生物标记,将能大大提高肾移植治疗效率。在此方面研究人员做了大量工作,主要方向为使用先进的科学技术从患者尿液和外周血中寻找排斥反应的早期生物标记,但目前这些研究成果均还未能运用于临床。微小RNA(microRNA, miRNA)是一类长约21~24nt的通过转录后负调控靶基因表达的非蛋白编码RNA分子。研究表明miRNA在胚胎发育,细胞分化及人类疾病的发生机制中起重要作用。新的生物标记能及时、可靠、特异地预示移植物的趋势,有助于进一步阐述排斥反应的发生机制。本研究的目的在于应用miRNA芯片技术,筛选在肾移植急性、慢性排斥反应中差异表达显著的miRNA,并通过预测差异表达miRNA靶分子,进一步探讨miRNA在肾移植排斥反应中的作用机制。研究材料与方法:1.取3例自肾肿瘤切除术中远离肿瘤组织且病理检查正常的肾皮质做为实验对照组;3例肾移植急性排斥反应患者肾穿标本做为肾移植急性排斥组;4例肾移植慢性排斥反应患者肾穿标本做为肾移植急性排斥组。2. Trizol法分离总RNA,使用紫外吸收测定法和变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。3.标记所提取总RNA中的miRNA,浓缩标记样品,采用miRCURYTM Array microarray kit试剂盒进行miRNA芯片杂交。4.使用Genepix 4000B进行图像扫描,使用635nm激发,图像存成TIF文件;采用Genepix Pro 6.0分析数据,分析结果导出,最终用EXCEL文件表示。5.实时定量PCR技术验证芯片结果6.TargetScan软件预测差异表达miRNA靶基因,寻找与肾移植排斥反应发生相关的分子。实验结果:1.所提取的RNA经过检测符合芯片实验需求。2.急性排斥组和对照组芯片研究结果发现21个miRNA差异表达显著,其中13个表达显著下调,8个表达显著上调。14个差异表达显著的miRNA可查询到序列和基因位点等信息。3.利用芯片比较分析慢性排斥组与对照组miRNA表达,发现63个miRNA差异表达显著。其中35个表达显著上调,28个miRNA表达显著下调。45个差异表达显著的miRNA可查询到序列和基因位点等信息。4.选急性排斥反应组中差异表达显著的hsa-miR-320,hsa-miR-324-3p和慢性排斥反应组中差异表达显著的hsa-miR-637,hsa-miR-648, hsa-miR-516-5p进行相对定量研究,其结果均符合芯片分析结果。5.应用TargetScan软件可预测到急性排斥组中13个差异表达显著的miRNA靶基因,总数为2617个;慢性排斥组中32个差异表达显著的miRNA靶基因,总数为7177个,其中6个与急性排斥组相同。急排和慢排组共可预测38个差异表达显著miRNA靶基因,其中18个miRNA靶基因与人类疾病有直接关系例如肿瘤和血液疾病等,20个miRNA在人类生理机理中起广泛调控作用。实验结论:1.微阵列芯片是有效的高通量分析肾移植排斥反应miRNA差异表达的研究手段。2.使用芯片筛选出20个在肾移植急性排斥反应中差异表达显著的miRNA;63个在肾移植慢性排斥反应中差异表达显著的miRNA,证实miRNA在肾移植排斥反应中出现显著的差异表达。3.用实时定量PCR对所挑选的5个miRNA进行定量表达研究,其结果与芯片结果一致,证实了芯片结果的可靠性。实时荧光定量PCR是检测单个miRNA表达水平的有效手段。4.预测的差异表达显著miRNA靶分子中包括多个肿瘤基因,血液疾病基因,并且广泛参与基因的转录调控过程,miRNA有可能是肾移植排斥反应的新的有效生物标记。差异表达miRNA的研究有助于进一步了解肾移植排斥反应发生的分子机制。