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黄颡鱼是中国最重要的淡水水产养殖物种之一。然而，其小体型和低产肉量限制了其经济价值。肌肉生长抑制素(Myostatin，Mstn)是转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）超家族的成员，对哺乳动物的肌肉生长起负向调控作用。在人、牛、小鼠、羊和狗等哺乳动物中发现的Mstn突变导致了“双肌”表型。Mstn在鱼类中也是保守的，但鱼类中尚未发现mstn的无效突变，因而对鱼类的MSTN功能的了解仍然是不透彻的。鱼类的基因组经历过多次复制，多种鱼类有多于一个mstn基因。 为了探讨mstn基因在鱼类生长中的作用，并创造黄颡鱼高产肉量的品系，我们设计了特异性的锌指核酸酶(ZFN)以靶向性地破坏黄颡鱼mstna基因，克隆并设计特异性的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)以靶向性地破坏黄颡鱼mstnb基因。利用建立的独特的斑马鱼胚胎筛选系统筛选鉴定ZFN活力，我们获得了一对可以编辑黄颡鱼基因组中的mstna基因的ZFN。利用ZFN，我们成功地获得了五尾首建者，其生殖细胞携带突变的mstna基因。我们共获得6尾mstnanju6/+，14尾mstnnju7/+黄颡鱼，8尾mstnanju12/+黄颡鱼，2尾mstnanju13/+黄颡鱼，40尾mstnanju14/+黄颡鱼，其中mstnanju6、mstnanju12、mstnanju13和mstnanju14是无效等位基因。通过mstna+/-杂合子突变体相互交配，我们获得了13尾mstnanju12/12纯合突变体、6尾带有两个无效突变等位基因的mstnanju12/14杂合突变体和4尾mstnanju14/14纯合突变体。分析这些mstna无效的突变体，我们发现mstna纯合突变的突变体比其杂合突变体或野生型的同胞的生长速度显著快。 与mstna基因相同，黄颡鱼mstnb含有三个外显子，预期编码373个氨基酸残基的蛋白。预测的Mstnb蛋白与黄颡鱼Mstna有59.3％的一致性，与人MSTN有57.3％的一致性。我们在随机挑选的四尾胚胎期注射了TALEN的黄颡鱼中得到了两尾在其生殖细胞中携带突变的mstnb的首建者。在上述首建者产生的子代中，我们共获得了6个突变的mstnb等位基因，其中4个为非移码突变，2个为移码突变。移码突变的等位基因包括mstnbnju22和mstnbnju2。mstnbnju22为8bp的缺失突变，mstnbnju24为缺失7bp、插入12bp的复合突变。这两个等位基因预期编码无功能的Mstnb。这一结果有助于研究mstn基因在鱼类生长中的功能。 GnRH是下丘脑-垂体-性腺轴中的重要上游激素，调控FSH和LH的分泌，在动物的生长与发育中起重要的调控作用。缺失GnRH的动物垂体和血液中的促性腺激素大幅减少，出生后生殖系统败育，没有生育力。我们克隆了黄颡鱼的两个gnrh基因，gnrh1和gnrh2。gnrh1含有三个外显子，预期编码71个氨基酸残基的蛋白;预测的GnRH1成熟十肽与人GnRH成熟十肽有80％的一致性。gnrh2含有四个外显子，预期编码86个氨基酸残基的蛋白;预测的GnRH2成熟十肽与黄颡鱼GnRH1成熟十肽有80％的一致性，与鸡GnRH2成熟十肽有100％的一致性。我们利用CRISPR/Cas9获得了体细胞中携带突变gnrh1和gnrh2的黄颡鱼，在获得的17尾突变体首建者中，13尾的体细胞中同时检测到gnrh1和gnrh2的突变。我们有望在后续工作中获得gnrh1和gnrh2均失活的双纯合突变体黄颡鱼，为培育不育的基因改造黄颡鱼建立技术体系。 斑马鱼是脊椎动物的遗传学模式动物。以往，斑马鱼中的反向遗传学手段比较有限，需要抑制基因表达时，通常用吗啉代寡核苷酸或siRNA进行基因敲降。包括锌指核酸内切酶技术，转录激活子样效应因子核酸内切酶技术和CRISPR/Cas9核酸内切酶技术等的人工内切酶使斑马鱼中任意位点的基因编辑有可能实现。本研究中，我们尝试在斑马鱼胚胎中利用人工内切酶制造双链断裂，提供同源供体，以实现基因打靶（Gene Targeting）的定向改造。我们测试了多种同源重组的条件，发现过表达rad51，抑制xrcc6(Ku70)等方法对提高基因打靶效率没有显著作用。利用CRISPR/Cas9切割并进行同源性介导修复，我们在斑马鱼aldh1a2的第四内含子中成功地实现一个完整mloxP的基因敲入。通过富集PGC细胞中人工内切酶辅助的同源修复，我们将插入/缺失突变的传代效率提高了2-3倍，将外源片段敲入的效率提高了6倍，在斑马鱼aldh1a2基因的第三内含子中基因敲入了完整的mloxP位点。这一结果将有助于在斑马鱼基因组中构建用作条件性敲除的等位基因，以实现在斑马鱼基因组中进行条件性敲除。 总之，本论文的研究工作制作了养殖鱼类中的首例基因敲除鱼，结合多种基因改造技术制作了多个基因敲除黄颡鱼品系，在斑马鱼中探索了进行高效同源重组整合的方法，为通过分子育种获得优良性状的养殖鱼类和高效、精确地编辑鱼类基因组建立了技术体系。