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目的:唾液腺多形性腺瘤(salivary pleomorphic adenoma,SPA)是最常见的唾液腺肿瘤,约占唾液腺上皮性肿瘤的50%以上。SPA是源于上皮病变的良性肿瘤,但具有交界性肿瘤的特征,“好种植、易复发”,多次复发可以癌变,给临床治疗带来极大困难。研究该肿瘤的生物学特性对其治疗和预后有重要意义。唾液腺多形性腺瘤由肿瘤性肌上皮细胞(neoplastic myoepithelialcells, NMCs)和腺上皮细胞构成。 NMCs具有分泌合成蛋白多糖(proteoglycans,PGs)的功能,通过胞吐作用将PGs分泌致细胞外基质,为SPA的黏液软骨样区域提供细胞来源。PGs是一类具有复杂结构的大分子糖蛋白,由核心蛋白(core protein)和连接其上的氨基聚糖(glocosaminoglycans,GAGs)侧链构成,与弹性纤维、胶原纤维及糖蛋白一起构成细胞外基质,是细胞外基质的主要组成成分。PGs参与机体各项生理功能和物质代谢过程,对细胞的生长、增殖、细胞间的信号传导、相互作用以及肿瘤细胞的粘附、转移、侵袭等生物行为有重要影响。PGs是在木糖基转移酶(xylosyltransferase,XT)的催化下进行合成的。目前已知的XT有两种,即XT-I和XT-II。XT-I是PGs合成的效率-限制阶段,对PGs的合成起至关重要的作用。XT-II是XT-I的一个亚型。二者的氨基酸的相似度小于55%,同样参与木糖基转移酶的合成。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是目前应用较广的一种基因研究技术。其核心是将与靶基因的mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA导入细胞,特异性地使细胞中的mRNA发生降解,从而使相应的基因得到沉默。本实验拟通过RNAi技术,沉默SPA细胞中指导PGs合成的关键起始酶XT-I,阻断PGs的生物合成。并通过肿瘤细胞体外侵袭实验,检测阻抑PGs合成、分泌后,SPA细胞侵袭性生物学行为的变化,为了解SPA侵袭性生物学行为的机制提供新的理论依据,并为SPA的临床治疗开创新的途径。方法:1细胞培养组织标本取自河北医科大学口腔医院口腔颌面外科一患者右侧腮腺原发肿瘤。采用组织块贴壁培养法,培养SPA细胞。培养液选用含20%胎牛血清的RPMI1640培养液,EDTA-胰酶消化液消化传代。2细胞鉴定SPA细胞传至第2代,采用兔抗人calponin单克隆抗体,鼠抗人S-100蛋白单克隆抗体,鼠抗人角蛋白8(cytokeratin8,CK8)单克隆抗体,进行免疫细胞化学鉴定。3细胞转染及分组通过脂质体转染SPA细胞,沉默其XT-I基因的表达。将阻抑XT-I的真核表达载体shRNA-WJ4转染SPA细胞,命名为SPA-WJ4(沉默组);将空载体shRNA-HK转染SPA细胞,命名为SPA-HK(空载体组);将未转染shRNA真核载体的SPA细胞组,命名为SPA(未转染组)。4沉默效率的检测采用Real-Time PCR技术,从mRNA水平检测基因沉默后SPA细胞中XT-I基因的表达。5PGs含量测定基因转染48h后收集细胞,应用Blyscan Assay Kit试剂盒检测基因沉默后三组SPA细胞PGs合成分泌的改变,并进行统计学分析。6细胞侵袭实验应用Transwell小室法检测基因沉默后细胞侵袭能力的改变。结果:1细胞培养SPA组织块原代培养5~7天,有细胞从组织块周围爬出。细胞呈短梭形,多角形,核大而居中。细胞呈多边形镶嵌排列。2细胞鉴定采用第2代细胞进行免疫细胞化学染色技术鉴定。SPA细胞抗S-100呈阳性反应;抗calponin呈阳性反应;抗CK8呈阳性反应。3细胞转染及筛选ShRNA-WJ4成功转染SPA细胞,转染后,细胞稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),转染效率44.2%。4沉默效率的检测基因转染48h后收集细胞,进行Real-Time PCR实时定量检测shRNA-WJ4细胞XT-I基因mRNA沉默效率为28.0%。5PGs含量测定应用Blyscan Assay Kit试剂盒检测基因沉默48h后三组细胞的PGs含量,其中SPA细胞PGs合成分泌降低27.20%。6细胞侵袭实验Transwell侵袭试验显示:SPA-WJ4组细胞穿过微孔膜到达下层的细胞数量为23.83±2.93个,较SPA-HK(64.50±3.94)和SPA(67.50±2.35)细胞明显减少(P<0.01),侵袭抑制率为64.70%。结论:靶向沉默XT-I基因,能有效阻抑SPA的PGs分泌,并有效抑制肿瘤细胞侵袭性生物学行为。