本研究通过分子生物学技术，如PCR 指纹法、PCR 特异扩增、PCR-RFLP、MLST、系统发育研究来分析我国新生隐球菌临床分离株的分子特征，旨在阐明我国新生隐球菌基因型和交配型在临床中的分布及其分子流行病学特征。主要工作包括以下三个部分： 一、PCR-RFLP和PCR 指纹法在新生隐球菌基因分型中的应用与比较 目的：探讨针对结构基因g6341的PCR－RFLP 方法在新生隐球菌基因分型中的应用价值，并与PCR 指纹分型法进行比较。方法：以野生型噬菌体M13 中针对小卫星DNA的核心序列为单引物，对受试的新生隐球菌进行PCR 指纹分型。选择结构基因g6341 进行PCRRFLP分析，在序列保守区设计通用引物，筛选合适的限制性内切酶进行RFLP 分析，并与PCR 指纹法进行比较。G6341 基因扩增片段测序，进行系统发育分析，研究各主要基因型间的亲缘关系。结果：多位点基因序列分析表明，结构基因g6341 可作为RFLP 分析的合适靶点。对76 株新生隐球菌的基因分型结果显示，针对g6341的PCR-RFLP 方法与PCR 指纹法结果一致。分析g6341 基因部分序列得出，8 种主要基因型菌株相互间的同源性在84％～97％之间，同一主要基因型菌株的同源性在99％～100％之间。分子发育树中，VNI－VNIV 基因型、VGI－VGIV 基因型分别聚在一类。结论：针对结构基因g6341的PCR-RFLP 方法可作为新生隐球菌分子分型的有效工具，对g6341 基因的序列分析可揭示不同菌株间的遗传进化关系。 二、国内110 株新生隐球菌临床株变种、基因型和交配型分析 目的：对国内部分地区的新生隐球菌临床株进行分子流行病学调查，分析其变种、基因型和交配型的构成和分布。方法：1、PCR 指纹分型法：以野生型噬菌体M13 中针对小卫星DNA的核心序列为单引物对模板进行PCR 扩增，将所有受试菌株鉴定到8 种主要基因型水平。2、利用变种和交配型特异性引物扩增分型法，区分格鲁比、新生和格特变种，同时鉴定α和a 交配型。结果：110 株临床株中，98株（89.1％）为格鲁比变种，均为VNI 基因型和α交配型；9 株（8.2％）格特变种，包括VGI 基因型、α交配型8 株（7.3％）和VGII基因型、α交配型1 株（0.9％）；2 株（1.8％）为AD 杂合体，VNIII基因型，-/α和α/-交配型各1 株；1 株（0.9％）为新生变种，VNIV基因型和a 交配型。结论：我国新生隐球菌临床株包含3 个变种和AD杂合体。与国外情况比较，相似的是国内临床株中绝大部分为α交配型菌株，且格鲁比变种中的VNI 基因型占了其中的大部分；但未发现VN II、VG III和VGIV 基因型菌株。 三、我国致病格特隐球菌的基因亚型分析 目的：分析我国致病格特隐球菌的基因型和基因亚型，探讨其与世界范围内格特隐球菌的亲缘关系和分子流行病学联系。方法：扩增国内9 株格特隐球菌临床株的3 个非连锁位点即IGS1（基因内间隔区）、PLB1（磷脂酶编码基因）和GEF1（交配型位点内基因）部分可变区片段，检索GenBank 上相应位点的核酸序列信息，进行多位点的序列比对和系统发育分析；选择针对MF 基因(编码性激素）的PCR 特异扩增法鉴定交配型。结果：1、国内8 株VGI 基因型和α交配型菌株在IGS1、PLB1和GEF1 位点上的所测序列与以菌株WM276为代表的一种基因亚型完全相同；国内首株VGII 基因型和α交配型菌株在IGS1和PLB1 位点所测序列与以菌株R272 为代表的一种基因亚型一致。2、针对GEF1 基因部分片段的序列和聚类分析准确鉴定受试格特隐球菌的基因型和交配型。结论：1、多位点序列分析表明，我国致病格特隐球菌VGI 基因型与世界上分布较广的一种基因亚型相似，国内首株VGII 基因型菌株与温哥华岛致病性弱的VGIIb 基因亚型亲缘关系接近。2、GEF1 基因的序列和聚类分析可用于格特隐球菌基因型和交配型的双重鉴定。