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研究背景随着器官移植的不断开展和深入研究,人们逐渐认识到细胞凋亡在器官移植中具有特殊的生物学意义。研究证实,细胞凋亡是导致肝脏缺血再灌注损伤的重要机制之一,也是影响肝移植成功的关键因素之一。人们以心肌细胞和神经细胞为对象,对阿片类药物在器官缺血再灌注损伤中的保护作用进行了深入的研究,结果显示蛋白激酶C(PKC)和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)参与了心肌和神经细胞的保护效应。PKC是一个富含丝苏氨基酸的激酶,由77～23Kd的多肽单链构成,除在凋亡方面发挥作用外,还参与调节神经兴奋性、突触塑形、细胞增生和分化、基因表达及细胞坏死。瑞芬太尼(Remifentanil)对肝脏缺血再灌注损伤的作用研究不多,PKC在其中的作用亦不清楚。目的本课题的目的是研究缺氧复氧肝细胞中PKC的表达变化,以及瑞芬太尼对缺氧复氧肝细胞的作用和对PKC表达的影响,探讨瑞芬太尼对肝细胞缺氧复氧损伤是否具有保护作用及其分子机理。方法实验分为两部分:1.瑞芬太尼对缺氧复氧的肝细胞是否产生影响使用HL-7702肝细胞株,建立肝细胞缺氧复氧损伤模型。将培养的肝细胞分为7组(A正常对照组;B单纯缺氧复氧组;C瑞芬太尼组:C1瑞芬浓度为5ng/ml;C2瑞芬浓度为10ng/ml;C3瑞芬浓度为20ng/ml;C4瑞芬浓度为30ng/ml;C5瑞芬浓度为40ng/ml。),每组6个样本,缺氧培养15小时,复氧5小时,然后分别取上清液和肝细胞线粒体,测定ALT、AST、MDA的含量和SOD的活性。2.瑞芬太尼对缺氧—复氧肝细胞的影响与蛋白激酶C-α(PKC-α)的关系将培养的人肝细胞分为5组,分别为正常对照(C)组,损伤(AR)组,瑞芬太尼(R)组,白屈菜红碱(CH)组,混合(R+CH)组,n=6,C组正常培养,其余各组缺氧培养15h,复氧5h,然后收集细胞,进行①肝细胞线粒体的丙二醛(MDA)含量测定;②用AnnexinV/PI染色,于流式细胞仪下计数凋亡细胞的百分数;③提取RNA,以PKC-αmRNA为目的基因,进行RT-PCR,然后电泳,对条带的吸光值进行比较。结果(1)与正常对照组相比较,损伤对照组的ALT、AST、MDA明显升高,而SOD活性明显下降(P＜0.05)。低浓度的瑞芬太尼(5 ng/ml、10 ng/ml、20ng/ml)能使细胞内ALT、AST、MDA明显降低(P＜0.05)及SOD活性明显升高(P＜0.05)。而瑞芬太尼浓度大于30ng/ml时,其结果与损伤对照组无明显差异。(2)AR组的MDA含量明显高于C组,R组和CH组的MDA含量介于AR与C组之间(P＜0.05)。(3)AR组的肝细胞凋亡率明显高于C组,R组和CH组的肝细胞凋亡率介于AR与C组之间(P＜0.05)。(4)AR组的PKC-αmRNA转录量明显高于C组,R组和CH组的PKC-αmRNA转录量介于AR与C组之间(P＜0.05),R+CH组的PKC-αmRNA转录量低于C组(P＜0.05)。(5)AR组肝细胞PKC-α的表达量多于C组和其它组细胞,R组和CH组的PKC-α表达量介于C组和AR组之间。结论1.肝细胞在缺氧复氧损伤时,其PKC-α的mRNA转录增加,PKC-α表达增多,活性增强。2.蛋白激酶C抑制剂白屈菜红碱能减轻缺氧复氧时肝细胞的凋亡。3.低浓度瑞芬太尼对缺氧复氧的肝细胞损伤具有保护作用。4.瑞芬太尼抑制PKC-α的mRNA转录进而减少PKC的表达是其减轻缺氧复氧时肝细胞凋亡的机制之一。