糖尿病性视网膜病变(Diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见的并发症之一，表现为特征性的血一视网膜屏障(Blood-retina Barrier,BRB)功能破坏，导致视网膜水肿、黄斑水肿等一系列病变。关于糖尿病性视网膜病变的确切机制尚不清楚，目前认为其为多因素综合作用的结果，包括如糖代谢异常、白细胞黏附性的增加、血管内皮细胞、周细胞以及神经细胞的凋亡等，共同参与增殖性糖尿病视网膜病变的病程发展。近年研究发现星形胶质细胞及Müller细胞在视网膜血管与神经细胞之间有着广泛且紧密的联系。 FK506最初是作为一种强效免疫抑制剂在临床开发应用。FK506通过与淋巴细胞内的相应受体(FK506 Binding Protein，FKBP)结合，发挥免疫抑制效应。最近发现，FKBP家族不仅存在于淋巴组织中，而且存在于非淋巴组织中，如心脏、骨骼肌、神经系统、新生内膜、表皮等，具有细胞周期调节、通道活性调节等多种生理功能。2000年Freeman等应用RT-PCR及wetem-blot等方法首次证实了在大鼠视网膜中存在FKBP-12的表达，并用免疫组化法确定了其在视网膜节细胞层、内核层中的表达，该作者还发现在视神经损伤的治疗过程中，FK506可能通过抗凋亡发挥对神经节细胞的保护作用，为FK506在各种视网膜疾病中的应用奠定了基础。 本课题从以下4个部分进行，简述如下： 第一部分人视网膜血管内皮细胞(HRCECs)的分离、培养、鉴定以及紧密连接蛋白在HRCECs的表达、分布及形态 目的 建立一种有效可行的人视网膜血管内皮细胞(HRCECs)培养方法，并探讨体外培养的HRCECs的生物学特性，包括生长曲线及紧密连接蛋白的表达，为视网膜血管性疾病的研究提供良好的材料。 方法 取新鲜尸体眼球，分离剪碎视网膜神经层，经胰酶及Ⅰ型胶原酶消化后，应用添加胰岛素-转铁蛋白-硒添加物(ITS)、β-人内皮细胞生长因子(β-ECGF)及10％胎牛血清的内皮细胞培养液培养；用第VIII因子相关抗原抗体免疫组化鉴定所获得的细胞；应用MTT检测其生长过程并绘制生长曲线；用紧密连接蛋白Occludin及ZO-l免疫组化法观察不同融合状态HRCECs的的表达、分布及形态。 结果Ⅰ1 应用ITS和β-ECGF的人血管内皮细胞培养液成功地分离、培养了纯度较 高的HRCECs。 2 体外培养的HRCECs可表达Occludin及ZO-l等紧密连接蛋白。 3 在未融合或过度融合的细胞中，紧密连接蛋白表达于细胞胞浆内；部分融合 区域可见紧密连接蛋白呈线状分布于相邻的细胞边缘。 第二部分紧密连接蛋白及胶质细胞在糖尿病大鼠视网膜的动态变化 目的 观察在糖尿病视网膜病变过程中视网膜血管紧密连接蛋白Occludin的时空表达改变、神经胶质细胞的活性改变以及神经元凋亡的发展过程，探讨在糖尿病病变过程中视网膜胶质细胞、血．视网膜屏障及神经细胞凋亡之间的时程关系。 方法 l血一视网膜屏障功能的形态学观察： 成年雄性Wistar大鼠，STz腹腔注射诱导糖尿病，分别取成模后1、3、6个月大鼠行伊凡思蓝(EB)静脉注射，2小时后摘出眼球，固定后取视网膜制备全视网膜平铺片，用激发光为546nm波长的滤光片在荧光显微镜下观察染料的位置并摄片。 2视网膜铺片Occludin表达时空动态变化 成年雄性Wistar大鼠，STZ腹腔注射诱导糖尿病，分别取成模后1、3、6个月大鼠行心脏灌注去除血管中血液成分，摘出眼球，固定后取视网膜制备全视网膜铺片，应用免疫荧光组织化学技术检测Occlhdin的表达及形态改变，用激光共焦扫描显微镜(激发波长为488nm激光)观察并摄片，并应用Z-stacks功能重建同一血管节段紧密连接的立体结构。 3神经胶质细胞活性标记蛋白——GFAP的时空表达变化 分别取成模后1、3、6个月大鼠眼球固定、石蜡包埋、切片后，应用免疫荧光组织化学技术检测GFAP的动态表达变化，荧光显微镜观察。取成模后1、3、6个月大鼠行心脏灌注去除血管中血液成分，摘出眼球，固定后取视网膜制备全视网膜铺片，应用双标免疫荧光组织化学技术检测ZO一1／GFAP的表达及形态改变，利用ZO一1标记视网膜血管，显示胶质细胞与血管之间的关系。用激光共焦扫描显微镜(激发波长为488nm激光)观察并摄片。 4 TUNEL法检测凋亡细胞 取成模后2周、1月、3月、6月的糖尿病大鼠眼球固定、石蜡包埋、切片。应用核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口翻译法(terminal transferase dUTP nick endlabeling，TUNEL)检测视网膜细胞凋亡情况。 结果 1血-视网膜屏障功能改变 EB注射后，视网膜平铺片在荧光显微镜下可清晰地观察到视网膜各级血管 的形态。正常状态下视网膜血管管壁清晰，染料在血管内没有外漏。糖尿病1个月的大鼠视网膜血管内的荧光染料未见明显渗漏增加，仅见背景荧光增强；糖 尿病3个月后出现局部的渗漏，以毛细血管的渗漏增强为主；糖尿病6个月出现广泛的荧光染料渗漏，血管壁模糊。 2视网膜铺片Occludin表达动态变化 正常大鼠Occludin表达于视网膜各级血管中，形态各异。在毛细血管呈双线或单线状，以双线为主；动脉中呈网状规则排列。糖尿病起病后1个月大鼠血管Occludin虽未见荧光强度减弱但可见形态的改变，排列紊乱，局部出现点状荧光增多。Occludin的表达在3个月时明显下降，动脉及毛细血管中可见荧光网线的中断，毛细血管以单线为主。6个月时，可见视网膜毛细血管中以单线状表达为主伴中断，动脉中可见网格稀疏，排列异常弯曲。 3凋亡在糖尿病大鼠视网膜中的动态发展 正常大鼠视网膜各核中未见染色阳性，成模后2周大鼠节细胞层即可见少量凋亡细胞；成模后1个月节细胞层及内核层均可见少量染色阳性细胞；成模3个月后凋亡细胞明显增多，主要位于节细胞层及内核层，外核层出现少量棕色阳性细胞；成模后6个月，视网膜各核层均可见较多的胞核棕色染色。 4视网膜神经胶质细胞活性状态的动态变化 4.1正常大鼠视网膜仅神经纤维层及神经节细胞层见GFAP阳性红色荧光染色；成模1月后糖尿病鼠神经纤维层及神经节细胞层内GFAP表达增多；成模3月后不仅在神经纤维层及节细胞层中荧光强度增加，还可见丝状荧光贯穿内外核层；6个月后此改变更为明显。 第三部分：FK506对HRCECs增殖状态的影响 目的 观察FK506对常规、高糖及缺氧培养条件下的HRCECs的增殖状态、细胞周期的影响。 方法 1高糖、缺氧培养条件下HRCECs生长状态 取生长状态良好P3-P4代HRCECs，接种于96孔板，进行高糖(30mmol／l葡萄糖)或缺氧(125μmol／l氯化钴诱导)培养，用MTT法检测1、3、5、7天细胞的生长状态。 2 FK506对各种培养条件下HRCECs的影响 取生长状态良好P3-P4代HRCECs，接种于96孔板，按下表加入混合的干预培养液，分别于干预后24、48、72小时进行MTT检测。 结果 高糖培养抑制HRCECs的增殖，氯化钴诱导的体外缺氧模型可促进HRCECs增殖。 2 100pM的FK506对常规、缺氧及高糖培养的HRCECs的增殖均有显著的抑制作用，抑制作用于干预后24～48小时出现。 3 FK506影响高糖培养状态下的HRCECs的细胞周期，使G<,0>／G<,1>期的细胞比例增加，S期+G<,2>期的细胞比例减少。 4 FK506不影响常规培养及缺氧状态下的细胞周期，对各细胞周期的细胞比例无改变。 5 FK506可对高糖诱导的HRCECs凋亡有抑制作用。 6 FK506可通过诱导细胞凋亡抑制缺氧所致的HRCECs过度增殖。 第四部分 Fk506对糖尿病大鼠视网膜损伤的保护作用 目的 探讨FK506对糖尿病早期血一视网膜屏障破坏及神经细胞的凋亡是否具有保护作用。 方法 成年雄性Wistar大鼠，STz腹腔注射诱导糖尿病，取成模后14天大鼠选其中一眼玻璃体腔注射FK506 2.5ng，另一眼注射等量的稀释10000倍80％乙醇(药物溶剂)。手术后48小时取材进行以下检测：应用免疫荧光技术检测视网膜铺片Occludin的表达改变，评价血．视网膜屏障的改变(方法同第二部分)；取眼球行冰冻切片，每一载玻片中收三片冰冻切片，每切片相隔300μm，TUNEL法检测视网膜细胞凋亡情况，对每一切片阳性细胞进行计数，应用SPSS统计软件进行统计分析。 结果 1 糖尿病大鼠FK506注射眼毛细血管及动脉中Occludin表达呈梭形网状排列，排列紊乱、中断，在胞浆内即网眼中可伴点状染色，空白对照眼毛细血管及动脉中荧光强度较弱，网眼的排列更为紊乱，中断现象严重。 2糖尿病大鼠对照眼视网膜节细胞层见少量的凋亡细胞，9.2±3.4个／切片，FK506注射眼未发现凋亡细胞，两组比较有显著性差异。