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在盐胁迫环境中,植物细胞的离子均衡受到破坏,尤其是胞质中过多的Na+,对植物细胞的代谢产生毒害。植物获得耐盐能力的一个重要策略是建立新的离子均衡。离子均衡涉及钠离子的吸收、外排、区隔化和长距离转运。植物的耐盐往往要求地上部分保持低Na+、高K+的状态,维持细胞质内低Na+状态最直接的方法是将Na+区隔化到液泡中,Na+区隔化对植物耐盐至关重要,而植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白是植物细胞中Na+区隔化至液泡的关键基因,它能利用液泡膜H+-ATPase及PPiase泵H+产生的驱动力,逆着Na+浓度梯度,将胞质中的Na+区隔化进液泡中。在多种植物中过量表达液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白都明显提高了转基因植物的耐盐性。甜菜Na+/H+逆向转运蛋白是组成性表达的,但盐诱导条件下其转运活力增强,酵母互补试验证明它能恢复酵母突变体液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的活性。本试验所研究的BvNHX1基因是从甜菜cDNA中克隆所得,它编码一个液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白,主要负责Na+的区隔化。
本实验利用植物表达载体pROKⅡ和农杆菌GV3101将BvNHX1(全长1659bp)、AtNHX5(全长1554bp)基因在拟南芥中过量表达。在含40mg/L卡那霉素的培养基上筛选获得BvNHX1和AtNHX5的纯合转化子,并对其进行了分子鉴定和耐盐性分析。
BvNHX1和AtNHX5的纯合转化子的分子鉴定及耐盐性分析结果如下:
1.Southem杂交结果显示,野生型植株(对照)没有明显的杂交信号,转基因株系有强阳性信号。表明BvNHX1、AtNHX5的确已经整合到拟南芥的基因组中,但不同株系插入拷贝数不等。
2.Northern杂交结果显示有杂交信号,表明插入拟南芥中的BvNHX1、AtNHX5已经正常转录,但不同转基因株系杂交信号强弱不同,表明不同株系表达量不同。
3.在不同盐浓度处理下转基因株系生长情况好于野生型对照。
4.测量不同浓度NaCl处理后野生型和转基因植株的干重、鲜重,结果表明胁迫下不同转基因植株的干重、鲜重相对高于对照。
5.测量不同浓度NaCl处理后野生型和转基因植株的Na+、K+含量,结果表明胁迫下不同转基因植株的Na+、K+含量均高于对照。
6.在含不同浓度NaCl的MS培养基上,转基因植株的生长明显好于野生型植株。以上结果表明,过量表达BvNHX1和AtNHX5基因可能增强了拟南芥将Na+区隔化至液泡的能力,提高了转基因拟南芥的耐盐能力。