伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemconmitans , Aa）是青少年牙周炎的主要致病菌，也是近年来研究得较为广泛的一种牙周致病菌，对牙周组织有毒性和破坏作用，同时可引发宿主免疫反应。近年来，有学者证实牙周病的发生发展有细胞凋亡的参与。大量学者通过免疫组织化学研究证实，淋巴细胞对于牙周致病菌在牙周炎组织内所产生的免疫反应起着重要的调节作用。有人证明Aa产物释放的白细胞毒素可引起人外周血中的淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞发生凋亡，对于Aa菌体本身在宿主免疫应答过程中所起的作用末见祥尽报道。所以本实验选取Aa为研究对象，通过洗涤过程去除白细胞毒素而得志Aa菌体，利用它来体外刺激外周血淋巴细胞，研究与淋巴细胞凋亡有关的Fas-FasL凋亡途径，进而阐明Aa菌体在牙周致病过程中的免疫学机理。本题选取伴放线放线杆菌Y4（血清型为b型）为主要研究对象，主要实验步骤如下：1、培养伴放线放线杆菌以富含胎牛血清的胰蛋白胨－大豆琼脂（TS琼脂）作为培养基培养伴放线放线杆菌，在37℃孵箱含10%CO2的条件下厌氧培养48小时，<WP=41>并用革兰氏染色及一系列生化反应鉴定该细菌并进行纯化培养。2、提取Aa菌体：用和生理盐水将菌落从培养基表面洗脱并离心3000转/分，30分钟，弃去上清，重复上述步骤一次，取沉淀，Aa产生释放的白细胞互素均在菌液中，利用此法可去除洗液中含有的培养基杂质及白细胞毒素。3、从外周血中分离淋巴细胞：选取10名全身及牙周健康受试者静脉血（每人20毫升）每毫升血加入20单位肝素抗凝，用F高密梯度离心法分离出淋巴细胞。4、Aa菌体刺激淋巴细胞：将浓度为10/细胞悬浮于IMDM和10%胎牛血清所组成的培养基中，在37℃、5%CO2的孵箱中孵育0-96小时。A实验淋巴细胞分为三组：实验组内加入Aa冻干产物（浓度为25μg/ml），阳性对照组内加入刺激抗原PMA（25μg/ml）+ionomycin(1μg/ml),阴性对照组不加任何刺激抗原，仅为淋巴细胞的培养液。B实验先用纯化的抗Fas单克隆抗体对淋巴细胞预处理30分钟，然后分两组：实验组内加入Aa冻干产物（浓度为25μg/ml），阴性对照组不加任何刺激抗原，仅为淋巴细胞的培养液。5、流式细胞仪检测：A实验使用特异性单克隆抗体（Fas、FasL）免疫荧光标记法进行荧光标记，免疫荧光标记的细胞通过流式细胞仪，所获得的数据通过T淋巴细胞进行活门限定。B实验使用荧光探针<WP=42>AnnexinV-FITC、PI进行淋巴细胞标记，然后上流式细胞仪进行分析。本实验结果显示：Aa刺激外周血淋巴细胞后T细胞上Fas和FasL的表达呈时限性递增，在24小时内维持在较低水平，培养24小时后，阳性对照组和实验组Fas和FasL的表达明显上调，表现出明显差异，48-96小时Fas的表达量：阳性对照组约为80%，Aa组约为69%，而阴性对照组约为28%。48-96小时FasL的表达量：阳性对照组约为45%，Aa组约为25%。而阴性对照组约为3%，在72小时的时间点各项表达达顶峰。我们发现各实验组显著差异首先出现在培养后第48小时，阳性对照组的Fas和FasL表达百分数明显高于Aa组，而Aa组明显高于阴性对照组，并且二者之间的差距在72小时和96小时时间点上有所扩大，说明Aa诱导T淋巴细胞主要通过Fas-FasL发生细胞凋亡，这种作用有时间依赖性。本实验研究了与Aa诱导T淋巴细胞凋亡有关的Fas -FasL途径的分子和细胞机制，在细胞凋亡的分子机制上得到了数据证明，T淋巴细胞暴露于天然的Aa，显示了Fas和FasL的上调，基于这些数据，也可研究其他细胞凋亡途径，为我们从分子水平探讨Aa对牙周疾病的致病性提供了依据。 <WP=43> 为了描述在Aa诱导T淋巴细胞凋亡中的Fas-FasL相互反应的作用，在细胞培养中加入抗Fas单克隆抗体，结果表明，用抗Fas单克隆抗体阻滞Fas-FasL相互作用导致明显的T细胞凋亡减少，加入抗Fas单克隆抗体后,T细胞凋亡百分比为22.72%,未加的为1.47%（P＜0.0005）。这个反应没有完全因抗Fas单克隆抗体而消失，残余的细胞凋亡活动比阴性对照仍高。说明抗Fas单克隆抗体不能完全抑制Aa诱导的凋亡，我们还应研究其它的细胞凋亡途径，如肿瘤坏死因子途径，对于更全面地了解Aa致病性的机制是很重要的。本实验证实，Aa诱导T淋巴细胞主要通过Fas-FasL途径发生凋亡，这个巨大的反应在免疫反应中有很显著的影响。我们还由实验结果推测Aa还可诱导其通过其他途径凋亡，如肿瘤坏死因子凋亡途径等。而且Aa还可诱导其他细胞如单核细胞、B细胞等发生凋亡， 为临床上牙周病的预防和治疗提供了重要的理论依据。