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背景幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的感染可以引起慢性胃炎、胃腺癌等多种疾病。只有将其清除才能阻止以上疾病的发展。但近年来治愈率逐年下降,主要原因是幽门螺杆菌日益耐药。细菌形成生物膜是导致其耐受多种抗生素的重要原因之一,临床调查发现H.pylori在胃黏膜表面普遍可以形成生物膜。研究表明来自宿主免疫细胞的少量的氧化应激分子即可以启动细菌应激保护机制,刺激生物膜形成。而H.pylori感染胃上皮细胞可引起炎症反应并诱导产生大量活性氧分子。但炎性细胞所释放的活性氧分子是否可以诱导H.pylori形成生物膜尚未有报道。(p)ppGpp又称魔斑核苷酸,其主要功能为调节细菌压力应答,在适应氧应激压力时发挥重要作用。而在H.pylori中(p)ppGpp仅由SpoT合成。研究发现SpoT参与细菌适应多种压力环境,尤其是在适应氧应激过程中有重要作用,并且SpoT参与生物膜的形成。因此SpoT可能调控氧应激诱导H.pylori生物膜的形成。若是如此,其调控机制是什么?目的本课题以SpoT为中心,应用WGCNA系统解析H.pylori生物膜的耐药机制,即SpoT通过调控NapA参与H.pylori氧应激压力下生物膜的形成。进一步探究H.pylori在胃粘膜表面形成生物膜的诱导因素,以及活性氧分子是否可以诱导形成生物膜及其调控机制,为体内H.pylori的治疗与生物膜的清除提供线索。材料方法1.利用同源重组的方法构建基因敲除株△napA。2.菌落生物膜法诱导H.pylori标准株、H.pylori临床株生物膜的形成。3.薄层色谱法检测野生株H.pylori26695、△spoT、spoT*浮游状态和生物膜(50μM过氧化氢诱导)状态下(p)ppGpp的积累量。4.扫描电镜(SEM)、激光共聚焦显微镜(confocal)分别观察野生株H.pylori 26695、△spoT、spoT*、△napA的生物膜形成情况。5.琼脂平板稀释法检测野生株H.pylori 26695、△spoT、spoT*生物膜状态下对多种抗生素的MIC。6.转录组检测浮游状态野生株H.pylori 26695、△spoT以及生物膜状态野生株H.pylori 26695、△spoT的细菌(每组五个重复处理)基因表达情况,WGCNA聚类分析,找出影响生物膜形成并受spoT调控的相关基因。7.实时定量PCR分析浮游状态野生株H.pylori 26695和生物膜状态下野生株H.pylori 26695以上基因的表达情况,在临床耐药株中再次筛选确定表达倍数最高的基因napA。8.检测比较H.pylori 26695和△rpoN中中性粒细胞激活蛋白NapA的表达情况。结果1.预实验结果显示低浓度的过氧化氢对浮游菌生长无影响,高浓度的过氧化氢严重抑制幽门螺杆菌生长,据此找到适宜浓度范围为50-200 μM。考虑到体内过氧化氢浓度不会过高,我们选用终浓度为50 μM来模拟体内实际情况。2.相比于对数期的浮游菌,生物膜状态下的细菌积累了更多的(p)ppGpp。且与野生株H.pylori 26695和spoT*相比,△spoT生物膜状态下仅积累了极少的(p)ppGpp。3.对比野生株H.pylori 26695、spoT*,△spoT的SEM结果显示生物膜的胞外基质减少,黏连程度降低,confocal结果显示生物膜厚度降低,这表明敲除spoT基因后,H.pylori形成生物膜的能力下降,与生物膜的生长曲线结果一致。4.对比野生株H.pylori26695、spoT*,基因敲除株△spoT形成生物膜后对多种抗生素的MIC值明显降低,表明敲除spoT基因后,耐药性下降。5.基于四组(标准株浮游菌与生物膜,SpoT突变株浮游菌与生物膜)转录组数据通过WGCNA进行综合性分析,找到与生物膜形成与SpoT两个指征都高度相关的模块,通过Cytoscape对模块内基因进行共表达网络分析,综合已知基因功能筛选到9个关键靶基因。6.对关键靶基因通过RT-PCR进一步验证,结果显示相比于浮游菌,形成生物膜后的幽门螺杆菌野生株H.pylori26695中9个关键靶基因的表达量普遍升高,而在临床耐药株中进一步筛选,发现napA可能为关键基因。7.以野生株H.pylori 26695为亲本成功构建出napA基因敲除株。8.对比野生株H.pylori 26695,SEM、confocal结果显示,敲除napA基因后,菌株形成生物膜能力下降,耐药性下降。9.对比H.pylori 26695和△rpoN中napA的表达情况,结果显示敲除rpoN基因后,napA表达明显降低。结论SpoT在氧应激诱导的生物膜形成和多耐药中有重要作用,这个作用可能是通过调控NapA完成的,NapA的高表达促进H.pylori生物膜的形成,以减少氧应激损伤。