目前全球人群结核分枝杆菌感染严重,约有20亿人(世界人口的三分之一)已经感染了结核分枝杆菌。虽然国际社会一直给予极大的关注,各国政府也一直致力于结核病防治工作,结核病仍然严重危害着人们的健康。特别是近年来耐药结核菌株的出现和HIV共感染更使得结核防治工作变得任重道远。对于流行疾病的控制,有效的早期诊断和早期治疗无疑是整个防治环节中的首选切入点。鉴于此,开发新的抗结核的药物和疫苗,显得尤为迫切。但目前,对于结核杆菌致病、耐药和潜伏的机制尚不明了。对相关机制的探究,将会帮助我们更好的了解结核病与结核分枝杆菌,也将为药物和疫苗的研发打下坚实基础。结核分枝杆菌培养滤液中存在着大量可以被CD8+T细胞所识别的蛋白抗原。MPB70和MPB83就是结核分枝杆菌培养滤液中的主要分泌蛋白,也是一类保护性抗原。而MPB70和MPB83抗原蛋白的表达受到sigK(Rv0445c)的调节作用。与其临近的Rv0444C基因编码anti-sigK因子RskA,可以抑制SigK的功能。同时,我们在做前期临床菌株分型的过程中,注意到部分临床菌株中Rv0444c(242位)发生了单碱基突变(G→C),导致其编码的81位密码子由谷氨酸突变为天冬氨酸的错义突变。这一突变导致了anti-SigK因子失活,从而解除了对SigK的抑制,最后导致了抗原蛋白MPB70和MPB83发生表达变化。而MPB70和MPB83又是一组与细菌毒力有关联性的抗原蛋白。因此我们希望通过此次实验,尝试揭示不同RskA表达情况,以及242位错义突变对菌株毒力和胞内存活能力的影响,为更进一步研究结核分枝杆菌毒力、探究结核病发病机制做一些铺垫。本实验构建了RskA高表达菌株(RskA-High)、RskA低表达株(RskA-Low)、突变株(RskA-Mut),以及pMV261、pACT空质粒重组对照菌株,观察发现不同RskA蛋白表达水平对菌体、菌落形态无明显影响。而不同条件环境下胞外群体生长情况差异,和不同菌株胞内生长情况的差异显示,RskA-High菌株在胞内/低氧环境中表现出更好的适应性。RskA-Low菌株则表现出对胞内/低氧环境的不耐受。而RskA不同表达水平的各菌株攻击THP1细胞后,刺激诱导TNF-α水平的差异证实,RskA-High菌株刺激THP1细胞分泌TNF-α量更少,初步佐证了RskA-High菌株RskA蛋白高表达后抑制SigK因子,并负向调控毒力相关蛋白MPB70、MPB83。而菌株毒力的下降,使得菌株刺激细胞因子分泌的能力下降,从而更容易在胞内实现免疫逃逸,显示出较为良好的适存能力。为进一步获得佐证,基于RskA低表达菌株在胞内无法正常生长,我们选择了RskA-High、RskA-Mut和pMV261空质粒对照菌株,采取尾静脉注射的方式攻击C57BL/6小鼠,同时设置PBS组等量注射作为对照。7d、14d、21d、28d分批处死小鼠,观察活力情况变化、脏器和尾部表观变化,并对肺脾组织进行固定制片,通过HE染色进行病理检测分析。小鼠脏器超微结构的变化差异,显示出RskA-High菌株对小鼠脏器造成的损害较轻,提示RskA-High菌株毒力相对较弱,也进一步证实了RskA对于结核分枝杆菌MPB70和MPB83两种蛋白表达情况的负调控。综上所述,我们对RskA/SigK调节毒力相关蛋白进行了实验验证,通过胞内外细菌的培养情况,确认了RskA高表达菌株表现出更强的胞内生存能力。菌株攻击细胞后相关细胞因子的检测和小鼠的病理检测结果也显示,这一适应性是RskA高表达菌株通过负调控毒力相关蛋白,使得菌株减毒,减弱细胞免疫应答来达成的。