FT的可变剪切调控高、矮种椰子花期变异的分子机制研究

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根据椰子(Cocos nucifera L.)的外部形态特征可以将椰子分成两个种群,高种和矮种。高、矮种椰子在开花时间上存在巨大差异,高种椰子需要8-10年的时间完成从营养到生殖生长的转变,而矮种椰子仅需4-6年。花期是产量性状的一个分量,在模式植物以及诸多作物中相关研究较多。在植物中至少存在5种开花途径:包括春化途径,光周期途径,自主途径,GA途径以及年龄途径。椰子主要在热带种植,其开花相关的分子生物学研究未见报道。热带木本作物往往受光周期调控,短日照能促进其开花,我们实验已展现光周期途径的基因在椰子成熟期都诱导表达,同时,成花素基因Flowering locus T(FT),在高、矮种椰子中存在可变剪切,并且这种剪切方式与高、矮种显著关联。通过同源比对,我们鉴定了椰子开花信号传导途径相关候选基因;分析了它们在高、矮种椰子中的表达模式及其可变剪切,发现Suppressor of Overexpression of Constans1(SOC1,CCG008883)、FT(CCG011565)和Apetala 1(AP1,CCG027514)等基因在苗期表达量处于较低水平,而在成熟期都被诱导表达,其中,Cn FT6在高、矮种椰子中存在剪切方式的差异,高种椰子的m RNA比矮种椰子多6个碱基(两个氨基酸);在112个椰子单株中,验证了这种剪切方式差异与高、矮性状的关联度;通过酵母双杂实验,检验了两个Cn FT6蛋白与Cn FD的互作;克隆了两个Cn FT6转录本的c DNA,转化拟南芥验证其功能。详细试验结果如下:第一,在NCBI下载拟南芥174个开花基因的CDs序列,并与椰子CDs数据库进行blastn比对,在椰子的基因组上,一共鉴定出148个椰子开花候选基因,在它们中,74个基因属于光周期途径,11个基因属于赤霉素途径,63个属于春化和自主途径。第二,分析了148个开花候选基因在高、矮种椰子的苗期和成熟期的表达模式,发现SOC1基因(CCG008883)在高、矮椰子苗期的reads per kilobase per million mapped reads(RPKM)值分别为0.22和0.34,而在高、矮种椰子成熟期的RPKM值分别为55.16和50.12。FT(CCG011565)在高、矮椰子苗期的RPKM值分别为8.87和8.1,而在高、矮种椰子成熟期的RPKM值分别为38.18和48.14。AP1(CCG027514)在高、矮椰子苗期的RPKM值分别为0.74和0.15,而在高、矮种椰子成熟期的RPKM值分别为56.6和51.41。这些基因在椰子中成熟期都比幼苗期有更高的表达水平,这些结果说明这些基因对椰子的花期调控起着非常重要的作用。随后我们采用r MATS软件分析了高、矮种椰子苗期和成熟期的可变剪切,结果发现,Cn FT6在第四个外显子的5’端存在A3SS的可变剪切,导致高种椰子比矮种椰子的m RNA多6个碱基,我们将两种剪切体命名为Cn FT6a和Cn FT6b。同时,我们在112个椰子个体中,分析了此两种剪切方式与高、矮性状之间的关联度,结果表明Cn FT6两种剪切体在转录过程中可能存在一个转录变化,Cn FT6a的转录可能在苗期向成熟期转化的过程中变少,而较短的Cn FT6b变多,这两种转录本的转录变化可能是形成高、矮种椰子之间开花时间差异的重要原因,同时Cn FT6的可变剪切对高、矮种椰子的花期分化起着一定的作用。第三,为了验证Cn FT6的两个剪切本与Cn FD基因是否存在互作上的差异,首先我们分别克隆了两个转录本Cn FT6a和Cn FT6b的CDS基因序列,同时,也克隆了Cn FD基因的CDS序列(在椰子的基因组只存在一个拷贝),将Cn FT6a和Cn FT6b克隆到AD载体上,而将Cn FD克隆到BD载体上,通过酵母双杂实验,发现Cn FT的两个转录本蛋白跟Cn FD蛋白都存在互作关系。这些结果说明了Cn FT6两个转录本氨基酸的差异并不影响其与Cn FD蛋白的互作。第四,将Cn FT6基因两个转录本基因克隆到过表达载体p HB上:Cn FT6a-p HB和Cn FT6b-p HB,且成功转化野生型拟南芥得到2种转基因拟南芥植株。
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