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阿尔采末病(Alzheimer’s disease,AD)是一种进行性记忆减退、认知障碍为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病,病理改变以大脑皮层和海马等脑区的细胞外老年斑(senile plaques,SP)形成、细胞内出现神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)、神经突触的丢失和神经元大量死亡为特征。由于AD的发病机制不清,因而缺乏有效的预防与治疗手段。目前研究认为,NFTs和AD病人的痴呆症状密切相关,主要由双螺旋丝(pairhelical filament,PHF)和营养不良性轴突构成。尽管NFTs的形成机制尚未完全明了,然而近年来的研究提示tau蛋白的异常过度磷酸化与NFTs的形成有关。PHF主要包含高过度磷酸化的tau蛋白,因此tau蛋白过度磷酸化是引起AD病理改变的重要机制。目前认为,tau蛋白磷酸化程度是体内多种蛋白激酶的磷酸化和蛋白磷酸酶脱磷酸化两种作用平衡的结果。在体外实验和AD患者脑中都发现多种蛋白激酶和蛋白磷酸酶共同调节tau蛋白的磷酸化。因此,蛋白激酶和蛋白磷酸酶平衡紊乱可能是导致tau蛋白异常过度磷酸化的重要原因。体内调节tau蛋白磷酸化的蛋白激酶主要包括有丝分裂原蛋白激酶(MAPK)、细胞分裂周期蛋白激酶—2(cdc—2)、糖原合成酶激酶—3(GSK-3)等;调节tau去磷酸化的蛋白磷酸酶主要有蛋白磷酸酶—2A(PP2A)、PP1、PP2B和PP2C。体外研究证实,PP2A和PP1在限制tau蛋白异常磷酸化方面起关键作用。冈田酸(Okadaic acid,OA)是一种海洋生物提取物,对PP2A和PP1有选择性抑制作用。利用OA的这种特性,研究者在整体动物、细胞系或培养细胞复制出异常磷酸化的tau蛋白模型用于AD的研究。Humanin(HN)是日本学者通过对AD患者脑的枕叶(该脑区在AD病变过程中极少受累)提取cDNA文库的表达进行监测时发现的一个编码24肽的基因,它表达一条由24个氨基酸残基组成的线性多肽,分子量2656.3。实验者发现,HN具有抑制APP、PS1、PS2基因突变诱发的神经元死亡,拮抗Aβ(包括Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ25-35和其他Aβ多肽)诱导的神经细胞毒作用,而且这些神经保护作用似乎集中于AD相关的毒性因素引起的损伤。已有实验证实,HN除了抑制App突变和Aβ等诱导的神经细胞凋亡,还可抑制缺血缺氧及兴奋性神经毒引起的损伤,因而可能具有广泛的神经保护作用。我们推测HN对冈田酸诱导的tau蛋白异常过磷酸化也有一定的抑制作用。鉴于上述因素,我们设计了本实验,旨在观察HN是否通过抑制OA诱导的培养皮层神经元tau蛋白过度磷酸化而发挥保护作用。已知与AD有关的tau蛋白磷酸化位点有30个,我们在AD病人发生率较高的几个位点进行检测(Ser199/202、Ser396、Thr231)。方法:选用≤3天的Wistar大鼠,分离皮层神经元,阿糖胞苷去除胶质细胞纯化神经元。在单独加入不同浓度OA继续培养24小时,以及提前加入不同浓度HN孵育24小时后再加入OA,用Western-blot方法检测tau蛋白磷酸化程度的改变,以及GSK-3β表达水平的改变,并通过丝/苏氨酸蛋白磷酸酶活性检测试剂盒检测PP2A活性的变化。结果:1.原代细胞呈贴壁生长,一天后,倒置显微镜下观察细胞完全贴壁,形成椭圆形的芽胞状,周围有明显的光晕,细胞折光性好,活性强。这时加入阿糖胞苷抑制胶质细胞的生长,并观察细胞的增殖情况,依此决定阿糖胞苷的作用时间,得到纯化的神经元。培养至12天细胞生长良好,胞浆透明,突起发育好,随即加OA处理细胞。2.OA诱导的tau蛋白磷酸化及HN的拮抗作用观察:(1)不同浓度OA对神经元影响的镜下观察:加入不同浓度OA继续孵育24小时以后,倒置显微镜下观察发现:5nM组细胞同对照组相比无明显改变,细胞周围有明显的光晕,细胞折光性好,活性强;而10nM组中细胞突起有明显回缩,神经纤维网络也较对照组减少。20nm组中多数细胞胞体呈圆形,突起消失明显,死细胞明显增多。(2)OA对tau蛋白磷酸化的检测:OA处理以后,利用免疫印迹对大鼠皮层神经元中tau蛋白不同位点的磷酸化进行检测,结果发现tau蛋白在丝氨酸396、199/202及苏氨酸231位点上出现过度磷酸化。其中5nM OA组磷酸化水平与对照组比较无显著性差异(P＞0.05),10nM OA组磷酸化水平较正常组显著增高(P＜0.05),20nM OA组tau蛋白磷酸化水平较正常对照组也增高(P＜0.05)但增高程度小于10nM组(后续的实验观察采用10nM OA)。(3)HN拮抗OA对tau蛋白过磷酸化的作用观察:神经元培养至第12天时加入不同浓度的HN孵育神经元24小时后再加入10nM的OA处理,观察HN对OA诱导的tau蛋白磷酸化改变。结果发现,HN呈剂量依赖性地抑制OA诱导的tau蛋白磷酸化。5μM HN组中tau蛋白在前述几个位点仍然呈过度磷酸化状态,与OA组比较无显著性差异(P＞0.05);10μM HN组中tau蛋白磷酸化水平下降,较OA组有显著性差异(P＜0.05);20μM HN组tau蛋白磷酸化水平下降较OA组更为明显(P＜0.05)。3.OA诱导PP2A活性降低及HN的拮抗作用观察:(1)OA对PP2A活性的影响,不同浓度OA处理后PP2A活性较正常对照组都明显降低,并呈现剂量依赖性。此结果与前述tau蛋白磷酸化改变一致。对照组PP2A的OD值为1.403±0.124,10nM OA组的PP2A的OD值为0.749±0.092,活性明显下降(P＜0.01);20nM OA组PP2A的OD值为0.591±0.092,活性下降更为显著(P＜0.01)。(2)HN拮抗OA引起的PP2A活性降低:提前24小时加入HN进行预孵育,再加入10nMOA后,观察PP2A活性的改变情况。5uM HN组PP2A的OD值为0.799±0.104,活性较OA组(0.684±0.088)有所恢复,但仍低于正常对照组,10uM和20uM HN组PP2A的OD值分别为1.912±0.118和2.829±0.153,活性明显增加,与OA组相比具有显著性差异(P＜0.01)。4.OA对GSK-3β表达水平的影响及HN的作用观察(1)OA对GSK-3β表达水平的影响,OA处理以后,大鼠皮层神经元中GSK-3β表达水平的免疫印迹结果与对照组相比无明显改变(P＞0.05)。(2)HN对GSK-3β表达水平的影响,加入不同浓度的HN孵育神经元24小时后再加10nM OA进行处理,观察GSK-3β表达水平改变。结果显示,GSK-3β的表达水平与对照组无明显改变(P＞0.05)。结论:1.OA可通过抑制PP2A的活性,诱导皮层神经元tau蛋白Ser199/202、Ser396、Thr231位点的过度磷酸化。2.HN可通过抑制OA作用使PP2A的活性上调,防止神经元tau蛋白过度磷酸化。3.OA在抑制PP2A活性的同时并未使GSK-3β表达上调。4.HN对GSK-3β的表达无明显改变。